一种显齿蛇葡萄、大叶蛇葡萄和广东蛇葡萄的DNA鉴定方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种显齿蛇葡萄、大叶蛇葡萄和广东蛇葡萄的DNA鉴定方法。

背景技术

显齿蛇葡萄Ampelopsis grossedentata(Hand.-Mazz.)W.T.Wang是我国土家药中药材，亦是多功效、多道地产区民族中草药的典型代表，具有“清热解毒、祛风湿、强筋骨”等多种功效，现代研究发现其还具有消炎、止咳、祛痰、抑菌、降血压、降脂等作用，在多个省份中药材标准均有收载。显齿蛇葡萄作为地方民族药收录在《湖南药物志》、《广西药用植物名录》、《广西壮族自治区壮药质量标准》等专著中。显齿蛇葡萄其幼嫩茎叶作为土家药常用药使用已有数百年历史，并广泛分布于湘鄂赣、云贵川等地，民间亦采摘茎叶经炒制、揉搓晾干后作茶饮服用，鄂西部、湘中南地区称之为“藤茶”，湘西部称之为“莓茶”。由于显齿蛇葡萄野生资源日趋匮乏，正品和伪品在性状上极为相似，难以区分，市售商品莓茶不仅质量参差不齐，药源种属也非常混乱，如《湖北中草药志(二)》记载大叶蛇葡萄Ampelopsismegalophylla Diels et Gilg作为莓茶来源、《医疗机构处方常用土家药手册》记载广东蛇葡萄Ampelopsis cantoniensis(Hook.et Arn.)Planch.为莓茶基原物种，这些与显齿蛇葡萄功效或性状迥异的同属伪品药材常混淆流通于市，显齿蛇葡萄品种混乱问题非常严峻，其药效与安全问题甚是令人担忧。而且同属间不同物种，势必有效成分不同，功效各异，极易给患者造成危害，研究发现显齿蛇葡萄、大叶蛇葡萄和广东蛇葡萄在化学成分上存在较大差别，药理活性也存在不同程度的差异，物种来源在藤茶或莓茶化学成分组成中起着决定性作用。如何对同属难区分药材进行准确的物种鉴定已是生药领域关注的重要问题。

目前，对显齿蛇葡萄、大叶蛇葡萄和广东蛇葡萄的鉴定主要通过传统的性状特征和化学成分鉴别法来完成，而性状特征识别和化学成分鉴别具有主观性强、重复性差等特点，难以推广。近年来，随着分子生物学及生物信息学的快速发展，DNA条形码鉴别技术因不受外部环境、性状特征、生长发育状态等影响，操作简便快捷，且客观性、重复性和稳定性高等优点，已成为药用植物鉴定有效工具。

现有技术中，有研究人员采用DNA条形码建立了显齿蛇葡萄与同属其他物种的核基因组ITS2序列和叶绿体基因组psbA-trnH序列，为蛇葡萄属植物的鉴定提供了依据(夏叶，蛇葡萄属药用植物DNA分子鉴定及化学成分分析.湖北中医药大学，2013年)。但是，应用该方法针对显齿蛇葡萄与同属植物并未有效鉴别区分，另外迄今为止亦未发现任何基因组DNA条形码序列对显齿蛇葡萄、大叶蛇葡萄和广东蛇葡萄的鉴定方法的报道。

发明内容

本发明的主要目的是提出一种显齿蛇葡萄、大叶蛇葡萄和广东蛇葡萄的DNA鉴定方法，旨在提供一种操作简便、通用性强、鉴定效率高的DNA鉴定方法，并进一步寻找和建立蛇葡萄属植物便捷的鉴定方法。

为实现上述目的，本发明提出一种显齿蛇葡萄、大叶蛇葡萄和广东蛇葡萄的DNA鉴定方法，所述显齿蛇葡萄、大叶蛇葡萄和广东蛇葡萄的DNA鉴定方法，包括以下步骤：

S1、提供植物样本；

S2、提取所述植物样本中的基因组总DNA；

S3、使用如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物对，将所述基因组DNA进行PCR扩增，得到扩增产物；

S4、将所述扩增产物进行测序，获得核苷酸序列；

S5、去除所述核苷酸序列的两端引物区序列，获得trnK-UUU-rps16基因间隔区的核苷酸序列；

S6、将所述trnK-UUU-rps16基因间隔区的核苷酸序列分别与如SEQ IDNo.3、SEQID No.4和SEQ ID No.5所示的序列之中的至少一条进行比对。

可选地，在步骤S6之后还包括以下步骤：

若所述trnK-UUU-rps16基因间隔区的核苷酸序列存在如SEQ ID No.3所示序列，则鉴定所述植物为显齿蛇葡萄植物Ampelopsis grossedentata(Hand.-Mazz.)W.T.Wang；和/或，

若所述trnK-UUU-rps16基因间隔区的核苷酸序列存在SEQ ID No.4所示序列，则鉴定所述植物为大叶蛇葡萄Ampelopsis megalophylla Diels et Gilg；和/或，

若所述trnK-UUU-rps16基因间隔区的核苷酸序列存在SEQ ID No.5所示序列，则鉴定所述植物为广东蛇葡萄Ampelopsis cantoniensis(Hook.et Arn.)Planch。

可选地，在步骤S1中，所述植物样本为显齿蛇葡萄样本、大叶蛇葡萄样本和广东蛇葡萄样本。

可选地，步骤S2包括：将所述植物样本烘干得到干燥叶片，分别取干燥叶片研磨，用植物基因组DNA试剂盒提取植物样本中的基因组总DNA。

可选地，在步骤S3之前，包括以下步骤：

S30、将所述引物对用无菌去离子水溶解并稀释。

可选地，在步骤S3中，所述引物对包括：

SEQ ID No.1为正向trnK-UUU-rps16F；

SEQ ID No.2为反向trnK-UUU-rps16R。

可选地，在步骤S3之后，包括以下步骤：

S31、将所述扩增产物上样至琼脂糖凝胶电泳点样孔中进行检测，电泳完成后在凝胶成像系统上成像。

可选地，在步骤S4中，所述测序包括正反向测序和重复测序之中的至少一种。

可选地，步骤S4包括：

将所述扩增产物进行纯化和测序，然后进行测序峰图校对和序列拼接，获得核苷酸序列。

可选地，在步骤S5中，采用隐马尔科夫模型的Hidden Markov Model注释方法去除所述核苷酸序列的两端引物区序列。

本发明提供的技术方案中，首先提取植物DNA，然后采用特定的引物进行PCR扩增，以得到显齿蛇葡萄叶绿体基因组trnK-UUU-rps16基因间隔片段，该叶绿体基因组间隔片段进化速度慢，遗传稳定性高，该技术方法鉴定效率高、成本低、通用性强、客观性强、重复性高，且适合各层次人群进行操作。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1步骤(3)得到的凝胶电泳成像图；

图2(a)～(k)为本发明实施例1步骤(6)得到的序列比对图；

图3为本发明实施例1步骤(7)得到的系统发育树图。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

目前，对显齿蛇葡萄、大叶蛇葡萄和广东蛇葡萄的鉴定主要通过传统的性状特征和化学成分鉴别法来完成，而性状特征识别和化学成分鉴别具有主观性强、重复性差等特点，难以推广。近年来，随着分子生物学及生物信息学的快速发展，DNA条形码鉴别技术因不受外部环境、性状特征、生长发育状态等影响，操作简便快捷，且客观性、重复性和稳定性高等优点，已成为药用植物鉴定有效工具。现有技术中，有研究人员采用DNA条形码建立了显齿蛇葡萄与同属其他物种的核基因组ITS2序列和叶绿体基因组psbA-trnH序列，为蛇葡萄属植物的鉴定提供了依据(夏叶，蛇葡萄属药用植物DNA分子鉴定及化学成分分析.湖北中医药大学，2013年)。但是，应用该方法针对显齿蛇葡萄与同属植物并未有效鉴别区分，另外迄今为止亦未发现任何基因组DNA条形码序列对显齿蛇葡萄、大叶蛇葡萄和广东蛇葡萄的鉴定方法的报道。

鉴于此，本发明提出一种显齿蛇葡萄、大叶蛇葡萄和广东蛇葡萄的DNA鉴定方法，旨在解决同属的蛇葡萄属植物难区分的问题。

本发明提出一种显齿蛇葡萄、大叶蛇葡萄和广东蛇葡萄的DNA鉴定方法，包括以下步骤：

S1、提供植物样本；

S2、提取所述植物样本中的基因组总DNA；

S3、使用如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物对，将所述基因组DNA进行PCR扩增，得到扩增产物；

S4、将所述扩增产物进行测序，获得核苷酸序列；

S5、去除所述核苷酸序列的两端引物区序列，获得trnK-UUU-rps16基因间隔区的核苷酸序列；

S6、将所述trnK-UUU-rps16基因间隔区的核苷酸序列分别与如SEQ IDNo.3、SEQID No.4和SEQ ID No.5所示的序列之中的至少一条进行比对。

本发明提供的技术方案中，首先提取植物DNA，然后采用特定的引物进行PCR扩增，以得到显齿蛇葡萄叶绿体基因组trnK-UUU-rps16基因间隔片段，该叶绿体基因组间隔片段进化速度慢，遗传稳定性高，该技术方法鉴定效率高、成本低、通用性强、客观性强、重复性高，且适合各层次人群进行操作。

需要说明的是，基因组为目前作为植物研究领域研究的热点，其中主要包括核基因组、叶绿体基因组和线粒体基因组。目前药用植物DNA条形码研究中，核基因组片段占据主要位置，核基因组是细胞核内全部遗传系统的总和，其结构与组成较为复杂且冗长，易发生多拷贝现象，并存在直系同源和旁系同源等问题；线粒体基因组中易出现基因重排、重复和丢失，且拷贝数较低，提取和纯化困难，在药用植物鉴定中的应用范围十分有限；叶绿体基因组常作为DNA条形码辅助工具，该基因组大小合适，基因较少出现重复和重排，另外叶绿体基因组多属于母系遗传，不受遗传重组的影响，较适用于属及种等鉴定研究。药用植物叶绿体trnK-UUU-rps16基因间隔片段进化速度较慢，在属及种的水平上遗传变异较小，具有通用性强、易扩增等特点，在植物鉴别研究中常选取作为分子鉴定的DNA条形码。可以结合DNA快速提取检测技术，寻找和建立蛇葡萄属植物便捷的鉴定方法。本发明正是利用了叶绿体trnK-UUU-rps16基因间隔片段的遗传稳定性特点，提供一种快速、便捷区分同属的显齿蛇葡萄、大叶蛇葡萄和广东蛇葡萄的方法。

进一步地，在步骤S6之后还包括以下步骤：

S61、若所述trnK-UUU-rps16基因间隔区的核苷酸序列存在如SEQ IDNo.3所示序列，则鉴定所述植物为显齿蛇葡萄植物Ampelopsis grossedentata(Hand.-Mazz.)W.T.Wang；和/或，

S62、若所述trnK-UUU-rps16基因间隔区的核苷酸序列存在SEQ ID No.4所示序列，则鉴定所述植物为大叶蛇葡萄Ampelopsis megalophylla Diels et Gilg；和/或，

S63、若所述trnK-UUU-rps16基因间隔区的核苷酸序列存在SEQ ID No.5所示序列，则鉴定所述植物为广东蛇葡萄Ampelopsis cantoniensis(Hook.et Arn.)Planch。

上述三个步骤没有先后顺序，为并列的关系，本实施例中通过将待测样品的trnK-UUU-rps16基因间隔区的核苷酸序列分别与如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的序列进行对比，从而区分显齿蛇葡萄、大叶蛇葡萄和广东蛇葡萄，该方法简单快捷。其中SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5的核苷酸序列如下所示：

SEQ ID NO.3

>Ampelopsis grossedentata(Hand.-Mazz.)W.T.Wang

TCCATAATGGAGAATAGCTATAGCTAATAGTTAGGATTCATAAAAAAATCTATAATGACTCATGGGAAAAGCCTTTCCCGCATCAGGCACTAATATTTTTTTAACGTCTAATTAGATCGGGTAATCATTCACATTAAGAACAGAAGCTCGTTGCTTTTTTTGTTTCCCTATAATTTAATTGGAGCCATTAAGATTAAGGCTCTATCCATTTATTCACTCAACCCAACTTTGAATTCATTTTGTTCTGCTCT

AACAATTCAACCAAGGTTTTGTGCCGATTTGGTAAGAATGATATATTCTC

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TTCTATCCATCTTATATCAATAAGATAGATTTTTGTCGTTATAGAACATGGG

ATTCTGCAGGAGCAATAAGAAATAGGTATGAATAGAACAAGAGAAAGGG

GCAAGAGAAAGTTATACAAAGCTATATACGAGTCATCCCCCCCCTCGTTT

TTTGTATTTCATTGATTGAATTTTAATTTCGTTTGATTAAGACGAAGTTCC

GTAAAAACCTCCGCTTTCTTTGAAATATCATGAACAGTTCCTGTAGGTTG

AGCTCCTTTTTCAAGGAAATATAGAATAGCAGGAACATTTGAATAAGTTT

GATTCTTTATCGGATCATAAAAACCCACTTTCCGAAGATCTCTTCCTTCTC

TTCGGGATCGAGCATCAATTGCAACGATTCGATAGACGGCTCATTGGGAT

AGATGTAGGTGAACAACACCCCCCCCTAGAAACGTATAAGAAGTTTTCT

CCTCGTACGGCTCGAGAAAAATGATTCAAAGTTATGTCGATGTATAGAAT

TCCAATGGCAAATAGATCTATGAAATCATCAAATTCATTAGACTATGATTT

AAT

SEQ ID NO.4

>Ampelopsis megalophylla Diels et Gilg

TCCATAATGGAGAATAGCTATAGCTAATAGTTAGGATTCATAAAAAAATCTATAATGACTCATGGGAAAAGCCTTTCCCGCATCAGGCACTAATATTTTTTTAACGTCTAATTAGATCGGGTAATCATTCACATTAAGAACAGAAGCTCGTTGCTTTTTTTGTTTCCCTATAATTTAATTGGAGCCATTAAGATTAAGGCTCTATCCATTTATTCACTCAACCCAACTTTGAATTCATTTTGTTCTGCTCTAACAATTCAAACAAGGTTTTGTGCCGATTTGGTAAGAATGATATATTCTCAGAATTCTCCATTGATAATTGATACGACATGCTGTTTTTTCCATTCATTCCCTTTCAGGATCAGTCGCGGTCTTACAAACTATACCAATGGTATGGACGAATCCGTTCCTTCATCCAAATGTGTAAAAGATTCTAGCCGCACTTAAAAGCCGAGTACTCTACCGTTGAGTTAGCAACCCGAATAAGATTCAATTCAATTCAAATAATTAGAGTATGTAGATATAACCGGAATCAAAACAAATAACGTAAAGAGATTGGGTCACACGACGCAATCAAAACATTGAACTAGCAATAAAATAAATAAAATAGAAAAAAAACACATTTTCTAATCGATTCTGAACATAAAAATGAACAGCTCAGGTGAAAATACAAGAAATTCTTAGTTATTAGATAGATAAATGTCCAAATTTATAGACCAACTCTTATCTTATCCATTTTTTTGATTGAAAAAAACGGCTTATAGCACAGCGACTACAACGAAACCATCATTTGAATGGGGTAAAGTAAAAACCAAACCTATGTAACGGAGAAAAAAAGATCCATTTATCTACGATCAAATTATATTTTTTTTCTACACAGTTGTCAATATGAATGAATGTTGAGAAAAGAATACAATGTAGAAAACAAAAAAAAAAATTCAAATTGAATAAATCTGAATTTAAATTCAAATAAAAAAAAAAATAAGGACTTGTGTTGGATTGGCACTATATAGATAATCTACATAGATACAAAAAAGGTATAGATGGAGAAATAAATAAGGAAAAAGTAGGAAAAAATCTCGGGTCTATTCAATCATCTATTCAATTAAAATCAATATAAAGAAAATGTATAATAAGCAAACTTGATCCCGTGTTTGTTAGTAGAGTTCTAAGAAAAACCGCCTGATTGAAGGTAATGTCAGAATTTTATATTTCTAGATATAATTCCTTCATCTATTCACTTGATCTTTTTTCTATCCATCTTATATCAATAAGATAGATTTTTGTCGTTATAGAACATGGGATTCTGCAGGAGCAATAATAAATAGGTATGAATAGAACAAGAGAAAGGGGCAAGAGAAAGTTATACAAAGCTATATACGAGTCATCCCCCCCCTCGTTTTTTGTATTTCATTGATTGAATTTTAATTTCGTTTGATTAAGACGAAGTTCCGTAAAAACCTCCGCTTTCTTTAAAATATCATGAACAGTTCCTGTAGGTTGAGCTCCTTTTTCAAGGAAATATAGAATAGCAGGAACATTTAAATAAGTTTGATTCTTTATCGGATCATAAAAACCCACTTTCCGAAGATCTCTTCCTTCTCTTCGGGATCGAGCATCAATTGCAACGATTCGATAGACGGCTCRTTGGGATAGATGTAGGTGAACAACACCCCCCCCTAGAAACGTATAAGAAGTTTTCTCCTCGTACGGCTCGAGAAAAATGATTCAAAGTTATGTCGATGTATAGAATTCCAATGGCAAATAGATCTATGAAATCATCAAATTCGTTAGACTATGATTTAAT

SEQ ID NO.5

>Ampelopsis cantoniensis(Hook.et Arn.)Planch

TCCATAATGGAGAATAGCTATAGCTAATAGTTAGGATTCATAAAAAAATCTATAATGACTCATGGGAAAAGCCTTTCCCGCATCAGGCACTAATATTTTTTTAACGTCTAATTAGATCGGGTAATCATTCACATTAAGAACAGAAGCTCGTTGCTTTTTTTGTTTCCCTATAATTTAATTGGAGCCATTAAGATTAAGGCTCTATCCATTTATTCACTCAACCCAACTTTGAATTCATTTTGTTCTGCTCTAACAATTCAAACAAGGTTTTGTGCCGATTTGGTAAGAATGATATATTCTCAGAATTCGCTATTGATAATTGATACGACATGCTGTTTTTTCCATTCATTCCCTTTCAGGATCAGTCGCGGTCTTACAAACTATACCAATGGTATGGACGAATCCGTTCCTTCATCCAAATGTGTAAAAGATTCTAGCCGCACTTAAAAGCCGAGTACTCTACCGTTGAGTTAGCAACCCGAATAAGATTAAATTCAATTCAAATAATTAGAGTATGTAGATATAACCGGAATCAAAACAAATAACGTAAAGAGATTGGGTCACACGACGCAATCAAAACATTGAACTAGCAATAAAATAAATAAAATATAAAAAAAACACATTTTCTAATCGATTCTGAACATAAAAATGAACAGCTCAGGTGAAAATACAAGAAATTCTTAGTTATTAGATAGATAAATGTCCAAATTTATAGACCAACTCTTATCTTATCCATTTTTTTGATTGAAAAAAACGGCTTATAGCACAGCGACTACAACGAAACCATCATTTGAATGGGGTAAAGTAAAAACCAAACCTATGTAACGGAGAAAAAAAGATCCATTTATCTACGATCAAATTATATTTTTTTTCTACACAGTTGTCAATATGAATGAATGTTGAGAAAAGAATACAATGTAGAAAAC-AAAAAAAAAATTCAAATTTAATA AATCTGAATTTAAATTCAAAT-AAAAAAAAAATAAGGACTTGTGTTGGAT TGGCACTATATAGATAATCTACATAGATACAAAAAAGGTATAGATGGAGAAATAAATAAGGAAAAAGTAGGAAAAAATCTCGGGTCTATTCAATCATCTATTCACTTAAAATCAATATAAAGAGAATGTATAAGAAGCAAACTGGATCCCGTGTTTGTTAGTAGAGTTCTAAGAAAAACCGCCTGATTGAAGGTAATGTCAGAATTTTATATTTCTAGATATAATTCCTTCATCTATTCACTTGATCTTTTTTCTATCCATCTTATATCAATAAGAGAGATTTTTGTCGTTATAGAACATGGGATTCTGCAGGAGCAATAAGAAATAGGTATGAATAGAACAAGAGAAAGGGGCAAGAGAAAGTTATACAAAGCTATATACGAGTCATCCCCCCCCTCGTTTTTTGTATTTCATTGATTGAATTTTAATTTCGTTTGATTAAGACGAAGTTCCGTAAAAACCTCCGCTTTCTTTGAAATATCATGAACAGTTCCTGTAGGTTGAGCTCCTTTTTCAAGGAAATATAGAATAGCAGGAACATTTGAATAAGTTTGATTCTTTATCGGATCATAAAAACCCACTTTCCGAAGATCTCTTCCTTCTCTTCGGGATCGAGCATCAATTGCAACGATTCGATAGACGGCTCATTGGGATAGATGTAGGTGAACAACACCCCCCCCTAGAAACGTATAAGAAGTTTTCTCCTCGTACGGCTCGAGAAAAATGATTCAAAGTTATGTCGATGTATAGAATTCCAATGGCAAATAGATCTATGAAATCATCAAATTCATTAGACTATGATTTAAT

在步骤S6之后还包括以下步骤：

S64、将trnK-UUU-rps16基因间隔区的核苷酸序列分别与选自如下一条或多条的序列进行比对：SEQ ID No.4和SEQ ID No.5；

S65、若与SEQ ID No.4和/或SEQ ID No.5所示序列相同，则鉴定所述显齿蛇葡萄植物中掺杂有大叶蛇葡萄植物和/或广东蛇葡萄植物。

目前市场上存在很多用大叶蛇葡萄植物或广东蛇葡萄植物来冒充显齿蛇葡萄，而在显齿蛇葡萄中掺杂大叶蛇葡萄植物和/或广东蛇葡萄植物，上述步骤通过将待测的显齿蛇葡萄样本的基因间隔区的核苷酸序列与如SEQ ID No.4和/或SEQ ID No.5所示的序列进行对比，如果与SEQ ID No.4和/或SEQ ID No.5相同，说明在上述样本中掺杂了大叶蛇葡萄植物和/或广东蛇葡萄植物，反之与SEQ ID No.4和/或SEQ ID No.5不相同，说明样本中没有掺杂大叶蛇葡萄植物和广东蛇葡萄植物，该方法用于鉴别显齿蛇葡萄中是否掺杂有同属的易混淆的叶蛇葡萄植物和广东蛇葡萄，十分方便且有效。

可以理解的是，本发明提供的技术方案用于区分显齿蛇葡萄、大叶蛇葡萄和广东蛇葡萄，因此在上述步骤S1中，所述植物样本为显齿蛇葡萄样本、大叶蛇葡萄样本和广东蛇葡萄样本，上述样本可以从不同的产地进行采集，以使得样本具有多样性。

所述步骤S2具体包括：将所述植物样本烘干得到干燥叶片，分别取干燥叶片研磨，用植物基因组DNA试剂盒提取植物样本中的基因组总DNA，本步骤中采用低温(30～50℃，优选为40℃)烘干植物样本，然后采用高通量组织研磨仪进行研磨，用植物基因组DNA试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，Cat#DP3112，Bioteke Corporation)提取总DNA，经过上述处理后，可以提取完整的总DNA。

进一步地，在步骤S3之前，包括以下步骤：

S30、将所述引物对用无菌去离子水溶解并稀释。

引物稀释后加入到PCR扩增反应器里进行扩增，所述PCR反应25μL反应体系为：2×Taq PCR MasterMix 12.5μL，正反向引物各1μL，DNA模版2至3μL(<100ng)，加灭菌去离子水至25μL。

具体地，在步骤S3中，所述引物对包括：SEQ ID No.1为正向trnK-UUU-rps16F，该正向核苷酸序列为5’-TTCTACACATTCATCTCCAC-3’；SEQ ID No.2为反向trnK-UUU-rps16R，该反向核苷酸序列为5’-TTGAGTTATGAGTACGAATGA-3’，通过设置特定的正、反向核苷酸序列，从而扩增出叶绿体trnK-UUU-rps16基因间隔片段，便于后续进行基因鉴定。

为了验证扩增的产物是否符合要求，在步骤S3之后，包括以下步骤：

S31、将所述扩增产物上样至琼脂糖凝胶电泳点样孔中进行检测，电泳完成后在凝胶成像系统上成像。

通过凝胶电泳判断扩增的DNA条带是否与预期的目标条带一致，得出扩增产物的准确性。

可以理解的是，在核苷酸测序的过程中，会由于操作或者样品等原因致使测序存在误差，因此本实施例在步骤S4中，所述测序包括正反向测序和重复测序之中的至少一种，通过正反向和重复测序，使得结果更准确，避免误差。

具体地的，步骤S4包括：将所述扩增产物进行纯化和测序(由上海美吉生物医药科技有限公司完成)，然后运用软件CodonCode Aligner 4.2.4(CodonCode Co.,德国)进行测序峰图校对和序列拼接，获得核苷酸序列，通过本步骤的操作可以得到纯化、准确的核苷酸序列。

进一步地，在步骤S5中，采用隐马尔科夫模型的Hidden Markov Model(HMM)注释方法去除所述核苷酸序列的两端的trnK-UUU-rps16F和trnK-UUU-rps16R区，获得完整的trnK-UUU-rps16序列。

以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

(1)提供样本：

收集不同产地的显齿蛇葡萄样本共3份，大叶蛇葡萄样本共3份，广东蛇葡萄样本共3份(详见表1)。

表1样本信息表

(2)DNA样本提取：

所有样本低温烘干(例如40℃)，分别取干燥叶片约30mg用高通量组织研磨仪(宁波新芝)以50Hz研磨120s，用植物基因组DNA试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，Cat#DP3112，Bioteke Corporation)提取总DNA。

(3)PCR扩增：

PCR扩增引物分别为：

正向trnK-UUU-rps16F(SEQ ID No.1)：5’-TTCTACACATTCATCTCCAC-3’；

反向trnK-UUU-rps16R(SEQ ID No.2)：5’-TTGAGTTATGAGTACGAATGA-3’。扩增引物由生工生物工程公司有限公司(北京)合成。引物用无菌去离子水溶解并稀释至2.5μmol/μL。

PCR反应25μL反应体系为：2×Taq PCR MasterMix 12.5μL，正反向引物各1μL，DNA模版2至3μL(<100ng)，加灭菌双蒸水至25μL。

PCR反应程序如下表2：

表2PCR反应程序表

PCR扩增反应结束后，分别取5μL扩增产物上样至1％的琼脂糖凝胶电泳点样孔中进行检测，电泳完成后在凝胶成像系统上成像，得图1。检测结果显示：所有实验样本均能扩出约1800bp的预期目标条带。

(4)测序

PCR扩增产物进行纯化和测序(由上海美吉生物医药科技有限公司完成)。引物经测序验证同本公开的PCR引物trnK-UUU-rps16F和trnK-UUU-rps16R。为确保trnK-UUU-rps16序列的可靠性，需进行正反向测序或重复测序，然后将正反向测序结果进行拼接获得准确的trnK-UUU-rps16序列。

(5)序列拼接

运用软件CodonCode Aligner 4.2.4(CodonCode Co.,德国)进行测序峰图校对和序列拼接，采用基于隐马尔科夫模型的Hidden Markov Model(HMM)注释方法去除trnK-UUU-rps16F和trnK-UUU-rps16R区，获得完整的trnK-UUU-rps16序列。

(6)序列比对

用DNAMAN V6软件对获得的trnK-UUU-rps16序列进行序列比对，得图2(a)～(k)，由图2(a)～(k)可见，显齿蛇葡萄Ampelopsis grossedentata(Hand.-Mazz.)W.T.Wang的trnK-UUU-rps16序列长度为232bp(SEQ IDNo.3)，大叶蛇葡萄Ampelopsis megalophyllaDiels et Gilg的trnK-UUU-rps16序列长度为232bp(SEQ ID No.4)，广东蛇葡萄Ampelopsis cantoniensis(Hook.et Arn.)Planch的trnK-UUU-rps16序列长度为232bp(SEQ ID No.5)，结果发现3个基原物种间trnK-UUU-rps16序列均存在明显差异，显齿蛇葡萄第262位点为C；第309、311位点为G、T；第491位点为C；第610位点为G；第946位点为G；第1105位点为C；第1124位点为G；第1134位点为G；第1144位点为G；第1277位点为T；第1322位点为G；第1475位点为G；第1544位点为G；第1790位点为A。表明应用trnK-UUU-rps16序列能够准确鉴定显齿蛇葡萄与混淆品大叶蛇葡萄和广东蛇葡萄。

(7)系统发育树(NJ数)构建

将获得的trnK-UUU-rps16序列导入MEGA 6软件中进行比对，用比对结果构建以K2P(Kimura 2-parameter)为模型的系统发育NJ树，得图3。结果显示显齿蛇葡萄、大叶蛇葡萄和广东蛇葡萄分别单独聚为一支，同样证明显齿蛇葡萄与大叶蛇葡萄和广东蛇葡萄能够准确区分。

本发明公开的方法适用性广泛，能检测所有能能获知trnK-UUU-rps16序列的的显齿蛇葡萄与大叶蛇葡萄和广东蛇葡萄样本的准确、快速、稳定鉴定。

以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。