一种肠道菌群代谢产物甘氨熊脱氧胆酸在制备防治骨质疏松症药物中的应用

技术领域

本发明属于骨科生物防治技术领域，涉及一种肠道菌群代谢产物甘氨熊脱氧胆酸在制备防治骨质疏松症药物中的应用。

背景技术

骨质疏松是一种常见于绝经后妇女的慢性代谢性骨疾病，其病理基础是破骨细胞的过度激活，导致骨吸收大于骨形成。骨质疏松以骨量减少、骨组织微结构损坏导致骨质脆性增加、易发骨折为特征，常伴有疼痛、乏力和脊柱变形等症状。骨质疏松的发病率高、病程长，据国际骨质疏松症基金会(IOF)调查发现，全世界有超过2亿女性罹患骨质疏松症，已成为严重的公共卫生问题。同时骨质疏松性骨折还是老年人常见的死亡原因之一，给个人、家庭和社会带来了沉重的经济负担。目前骨质疏松的发病机制，尤其是绝经后骨质疏松的发病机制尚不明确。骨质疏松常用的药物为双膦酸盐类，能够抑制破骨细胞的活性，减少骨吸收，但仍存在肌肉疼痛、自发性骨折和上颌骨坏死等副作用，因此亟需阐明骨质疏松的发病机制，并加速寻找新的安全有效的治疗手段。

研究发现肠道菌群稳态参与调节骨代谢和骨质疏松进展。肠道菌群是寄居在胃肠道的500多种微生物的集合，数量超过10万亿，形成了复杂的生物群落。其中专性厌氧菌拟杆菌属和厚壁菌属占主体，数量超过厌氧菌和兼性厌氧菌。肠道菌群通过直接与肠上皮细胞相互作用或通过其代谢物间接互作而对宿主的消化、免疫和内分泌系统产生影响。有研究表明，糖尿病、结肠炎和慢性炎症等代谢和免疫相关疾病均与宿主特定的肠道菌群或代谢物失衡有关。Macy Castaneda和Klara

目前基于肠道菌群失调的骨质疏松治疗手段主要以益生菌的干预为主。已有研究表明在OVX小鼠的饮食中补充枯草芽孢杆菌、乳酸菌等益生菌可逆转骨质疏松的疾病进程。相关机制可能与益生菌改善肠道通透性，减轻肠道炎症，抑制炎性因子分泌，降低破骨细胞活性有关。其对骨骼的保护作用在临床试验中也得到了证实，以乳糖为基础的益生元和益生菌之间的相互作用通过多种机制缓解骨质疏松症，预防骨质丢失。但益生菌存在保存不易，效果不明确，患者产生依赖性等问题，亟需寻找和开发基于肠道菌群代谢物的骨质疏松治疗药物。

胆汁酸是一类由肝细胞产生，由胆管分泌到肠道的两亲性代谢产物。初级胆汁酸由肝脏中的胆固醇合成，在肠道中被一些特殊的菌群种类转化为次级胆汁酸。熊脱氧胆酸(UDCA)是一种次级胆汁酸，与甘氨酸偶联可形成甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)。甘氨熊脱氧胆酸具有多种生物效应，如抗炎，抗氧化和抗凋亡和神经保护作用。近期研究证实，甘氨熊脱氧胆酸在高血糖患者体内显著减少。其血清含量的升高与II型糖尿病患者糖化血红蛋白和腰围的降低有关。此外，甘氨熊脱氧胆酸作为肠道内法尼醇X受体(FXR)的拮抗剂，显著减轻高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型的体重，改善葡萄糖耐受不良和胰岛素抵抗。甘氨熊脱氧胆酸的代谢调控作用或与肠道菌群密切相关。如马晓丽团队发现甘氨熊脱氧胆酸通过改变胆汁酸代谢积极调节肠道微生物群，可有效干预II型糖尿病进展。相关研究还证实甘氨熊脱氧胆酸可改善高脂饮食诱导的肠道菌群失调，从而调控胆固醇代谢，改善动脉粥样硬化的发展。但肠道菌群来源的甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)对骨代谢的影响未见相关报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种肠道菌群代谢产物甘氨熊脱氧胆酸在制备防治骨质疏松症药物中的应用，采用甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)用于防治骨质疏松尤其是绝经后骨质疏松，为骨质疏松的防治提供一种新的途径。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、一种肠道菌群代谢物甘氨熊脱氧胆酸在制备防治骨质疏松药物中的应用。

优选的，所述骨质疏松为绝经后骨质疏松症，其介导因素选自以下任一种或几种：股骨远端区域骨体积分数(BV/TV)降低、骨小梁数量(Tb.N)降低、骨小梁厚度(Tb.Th)降低、骨小梁分离度(Tb.Sp)增强、肠道菌群紊乱、肠道菌群代谢物甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)含量降低。

2、一种防治骨质疏松症的药物，其特征在于，其有效成分为甘氨熊脱氧胆酸。

优选的，所述甘氨熊脱氧胆酸用于提升骨体积分数(BV/TV)。

优选的，所述甘氨熊脱氧胆酸用于提升骨小梁数量(Tb.N)。

优选的，所述甘氨熊脱氧胆酸用于提升骨小梁厚度(Tb.Th)。

优选的，所述甘氨熊脱氧胆酸用于降低骨小梁分离度(Tb.Sp)。

优选的，所述甘氨熊脱氧胆酸用于参与调节肠道菌群紊乱。

本发明的有益效果在于：

申请人发现，在骨质疏松发病过程中，随着病情发展，肠道微生态紊乱所导致胆汁酸代谢产物甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)含量逐渐降低，间接促进破骨细胞过度激活，引起股骨远端区域骨溶解现象。为解决骨质疏松症所导致严重骨量丢失与骨破坏，其因肠道菌群代谢紊乱而引起的骨代谢失衡的问题，申请人经实验摸索发现肠道菌群胆汁酸代谢产物甘氨熊脱氧胆酸在骨质疏松骨丢失进展中发挥重要的保护作用，能够达到缓解骨质疏松症恶性进展的效果。本发明不仅拓宽了骨质疏松的治疗策略，还能更加安全的通过生物手段干预骨质疏松的恶性进展。

相对于对照组，甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)灌胃治疗组小鼠的BV/TV(P<0.01)、Tb.N(P<0.01)和Tb.Th无明显变化(p＞0.05)，Tb.Sp无明显变化(p＞0.05)。体内研究结果显示，灌胃给药GUDCA可以较好的改善绝经后骨质疏松动物模型骨丢失现象，在骨质疏松的有效防治策略中有着良好的应用前景。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明。

图1为绝经后骨质疏松动物模型与正常小鼠粪便胆汁酸代谢差异图，其中，A为小鼠粪便胆汁酸代谢物相对于对照组，OVX组小鼠的肠道菌群胆汁酸代谢物中GUDCA含量呈现明显下降趋势；B为小提琴图展示小鼠粪便胆汁酸代谢物GUDCA含量差异(p＜0.05)；C为柱状散点图展示小鼠粪便胆汁酸代谢物UDCA含量无显著性差异(p＞0.05)。

图2为绝经后骨质疏松动物模型micro-CT图以及骨计量参数定量统计，其中A为骨体积分数(BV/TV)，B为骨小梁数量(Tb.N)，C为骨小梁厚度(Tb.Th)，D为骨小梁分离度(Tb.Sp)。

图3为股骨远端micro-CT骨微结构计量参数分析结果，其中A为骨体积分数(BV/TV)，B为骨小梁数量(Tb.N)，C为骨小梁厚度(Tb.Th)，D为骨小梁分离度(Tb.Sp)。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

1)骨质疏松小鼠与正常对照小鼠粪便胆汁酸代谢差异

1.1OVX骨质疏松动物模型的构建

取10只8周龄C57BL/6J雌性野生型小鼠，体重为18-22g。戊巴比妥(50mg/kg)麻醉，进行OVX手术，术后缝合伤口避免感染，小鼠被随机分为两组，每组5只；

OVX组：每只日常饲养条件下维持8周；

对照组：每只日常饲养条件下维持8周；

1.2两组小鼠粪便胆汁酸代谢水平差异分析

将50mg肠道代谢物样品(不同分组的小鼠粪便)置于EP管中，加入400uL提取液。对混合物进行超声(10min)等处理后，-40℃静置，将样品于4℃条件下离心15min；取上清液至LC进样瓶中，用于UHPLC-MS/MS分析。流动相条件为使用Agilent 1290Infinity series超高效液相色谱仪，通过Waters ACQUITY UPLC BEH C18液相色谱柱对目标化合物进行色谱分离。液相色谱的A相为乙酸-乙酸铵-超纯水混合液(乙酸的质量浓度为0.01％，乙酸铵的浓度为5mmol/L)；B相为乙酸-乙腈混合液(乙酸的质量浓度为0.01％)，乙腈纯度为色谱级，一般纯度在99.9％以上。柱温箱温度为60℃，样品盘设为4℃，进样体积为1μL。质谱条件为使用Orbitrap Exploris 120高分辨质谱仪，以平行反应监测(Parallel ReactionMonitoring,PRM)模式进行质谱分析。离子源参数如下：Spray voltage＝+3500/-3100V,Aux gas(N2)temperature＝350℃,Capillary temperature＝320℃。将校准溶液依次稀释2倍后进行UHPLC-PRM-MS分析，通过其信噪比来计算方法的检出限和定量限。方法最低检出限(LLOD)定义为信噪比为3时所对应的化合物浓度，方法最低定量限(LLOQ)定义为信噪比为10时所对应的化合物浓度(US FDA guideline for bioanalytical methodvalidation)。方法的精密度通过QC样品重复进样的标准相对偏差(RSD)来评估。准确度通过QC样品的回收率(Recovery)来评估，测得浓度与理论浓度的百分比值即为回收率。

1.3骨计量参数检测

造模8周后每只小鼠分离股骨，去除多余肌肉组织，固定。眼球采血获得血液样本。通过小动物micro-CT检测骨微结构进行分析。管电压为50kV，管电流为0.1mA，分辨率为7μm。选定的感兴趣区(ROI)的3D参数用于数据分析，包括骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分离度(Tb.Sp)和骨体积分数(BV/TV)。

结果所示：如图1所示，其中，A为小鼠粪便胆汁酸代谢物相对于对照组，OVX组小鼠的肠道菌群胆汁酸代谢物中GUDCA含量呈现明显下降趋势；B为小提琴图展示小鼠粪便胆汁酸代谢物GUDCA含量差异(p＜0.05)；C为小提琴图展示小鼠粪便胆汁酸代谢物UDCA含量无显著性差异(p＞0.05)。因此得出结论：在骨质疏松进展过程中肠道菌群来源的UDCA并未发挥明显保护作用，随着骨质疏松恶性进展肠道菌群来源的GUDCA的含量明显降低，肠道菌群胆汁酸代谢产物GUDCA在OVX所致绝经后骨质疏松进展中发挥明显的保护作用。

如图2所示，相对于CT组，OVX组小鼠的BV/TV(P<0.01，图2中A)和Tb.N(P<0.01，图2中B)显著降低，Tb.Sp(P<0.05，图2中D)显著增加，Tb.Th(P＞0.05，图2中C)变化不明显。卵巢切除所致的雌激素缺损能够诱发绝经后骨质疏松症的发生发展。OVX小鼠骨体积分数，骨小梁数量以及厚度的指标高低与肠道菌群胆汁酸代谢产物GUDCA含量呈现明显正相关。因此得出结论肠道菌群胆汁酸代谢产物GUDCA在骨质疏松骨丢失中发挥骨保护作用。

2)GUDCA显著改善卵巢摘除术(OVX)导致的骨丢失

2.1OVX骨质疏松动物模型的构建与药物干预

取10只8周龄C57BL/6J雌性野生型小鼠，体重为18-22g。GUDCA购自阿拉丁公司。戊巴比妥(50mg/kg)麻醉，进行OVX手术，连续灌胃给药8周，小鼠被随机分为两组，

每组5只；

GUDCA干预组：每只灌胃给药100mg/kg/天，甘氨熊脱氧胆酸原液浓度为1mg/ml；

对照组：每只灌胃给予等量的生理盐水；

2.2骨计量参数检测

完成8周给药后每只小鼠分离股骨，去除多余肌肉组织，固定。眼球采血获得血液样本。通过小动物micro-CT检测骨微结构进行分析。管电压为50kV，管电流为0.1mA，分辨率为7um。选定的感兴趣区(ROI)的3D参数用于数据分析，包括骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分离度(Tb.Sp)和骨体积分数(BV/TV)。

结果所示：如图3所示，相对于OVX组，OVX+GUDCA组小鼠的BV/TV(P<0.05，图3中A)、Tb.N(P<0.05，图3中B)显著增加，Tb.Th和Tb.Sp变化不明显(P＞0.05，图3中C、D)。因此得出结论GUDCA能够对OVX导致的骨丢失起到保护作用。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。