本发明公开了一种热稳定性提高的脂肪酶突变体及其制备方法和应用，属于分子生物学技术领域。所述脂肪酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.13所示。本发明通过多序列比对和二硫键预测结果，对米根霉脂肪酶ROL进行热稳定性改造，大幅度的提高了米根霉脂肪酶ROL的热稳定性，同时，借助计算机模拟技术，对热稳定性提高的原理进行了分子层面的解释。本发明提供的脂肪酶突变体的热稳定性显著提升，再结合其本身具备的高Sn‑1,3选择性，使其更具工业化应用价值。
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