一种可防治桃褐腐病的林肯链霉菌及其应用

技术领域

本发明涉及果树病害防治领域，更特别地，涉及一种可防治桃褐腐病的林肯链霉菌及其应用。

背景技术

我国桃树栽培面积及桃产量居世界首位，是重要的产桃大国。桃是我国主要水果资源之一，在全国范围内均有种植，目前主要分布在华东和华北一带，其不仅营养丰富、味道甜美，同时能加工成果汁、罐头等，深受人们的喜爱，同时也带来了巨大的经济利益。据统计，2015年我国桃子的总产量、总消费量分别为1311万t、1320万t，总量约占全世界产桃总量的66％。但我国桃子的优果率比较低，主要原因是由于病原微生物侵染，导致烂果，严重影响桃果实的品质。

桃褐腐病又名果腐烂病、菌核病，是由子囊菌链核盘菌属Monilinia spp.引起的真菌病害。该病菌除了危害桃之外，还能对李、樱桃、杏等核果类果树，以及梨、苹果等仁果类果树造成危害。桃褐腐病菌在温暖湿润的条件下对桃树的花期和果实成熟期危害尤其严重，导致烂花落果。不仅如此，在采后褐腐病在储藏、运输及消费过程中桃褐腐病菌的危害更为严重，对水果的食用价值及果农的经济收入带来了巨大损失。

目前，对桃褐腐病的控制以化学药剂为主，化学药剂具有操作较为简便并且成本较低的优点，但是化学杀菌剂的使用容易导致病原菌抗药性增强和环境污染，并可能危害生态安全和人类健康。

为了克服植物病害的抗药性、减少化学杀菌剂对环境的污染、生态的破坏及农副产品中化学农药的残留，生防微生物具有独特的优势，利用生防菌的次生代谢产物制备的生物农药，具有无污染、无残留、不易使有害生物产生抗药性、与环境相容性高、对人畜安全等优点。因此，需要一种能够防治桃褐腐病的生防菌。

发明内容

为解决以上问题，本发明提供了一种可防治桃褐腐病的林肯链霉菌，2020年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.21377。

本发明还提供了上述林肯链霉菌在防治桃褐腐病中的应用。

本发明还提供了一种防治桃褐腐病的方法，包括将上述林肯链霉菌产生的挥发性物质施用于水果的果实上的步骤。

在一个具体实施方案中，所述方法包括以下步骤：

S1：培养所述林肯链霉菌，得到林肯链霉菌培养物；

S2：将所述林肯链霉菌培养物放置于所述水果的储存环境中，并且所述林肯链霉菌培养物与所述水果的储存环境具有气体交流。

在一个具体实施方案中，S1中，所述林肯链霉菌在高氏一号平板培养基上培养。

在一个具体实施方案中，S2中，所述水果的储存环境条件为温度30℃，湿度60％。

本发明还提供了一种抑制环境中桃褐腐病病原菌孢子增殖的方法，包括将上述林肯链霉菌产生的挥发性物质施用于所述环境中的步骤。

在一个具体实施方案中，将所述林肯链霉菌产生的挥发性物质施用于所述环境中通过将所述林肯链霉菌培养物放置于所述环境中来实现。

本发明的林肯链霉菌在平板上对桃褐腐病等多种植物病原菌有很强的抑制作用，其挥发性代谢产物对桃褐腐病的孢子产生有很好的防控效果。因为该菌株是从土壤分离获得，与自然生态具有天然的和谐相融性，与化学农药相比对土壤生态无毒副作用、无残留，因此，在病害的生物防治实践中具有潜在的商业开发和应用价值。该菌株还具有广谱拮抗活性，对柑桔溃疡病菌和烟草角斑病菌等病原细菌表现出较强的抑菌作用，也对烟草灰霉病菌、苹果腐烂病菌和烟草根黑腐病菌等病原真菌有很好的抑菌效果。

生物材料保藏

本发明纯化的林肯链霉菌JCP1-7于2020年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.21377。

附图说明

图1为林肯链霉菌JCP1-7的平板形态照片；

图2为林肯链霉菌JCP1-7的单菌落形态照片；

图3为林肯链霉菌JCP1-7的孢子链及气生菌丝显微照片；

图4为林肯链霉菌JCP1-7挥发性代谢产物色谱分析图；

图5示出了林肯链霉菌JCP1-7的挥发性物质对桃褐腐病菌病原菌的抑制作用；

图6示出了林肯链霉菌JCP1-7的挥发性物质对离体果实的桃褐腐病的控制作用。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

1、林肯链球菌JCP1-7的鉴定与保藏

本团队从重庆市北碚、沙坪坝、巴南、南岸4个地区，采集的主要是草坪、竹林、行道树等非农田生态系统的根际土壤，分离获得的多个菌株经初筛和复筛,并在研究过程中分离出一株对桃褐腐病相关真菌具有抑制作用的菌株JCP1-7。

将菌株JCP1-7在高氏一号培养平板上于28℃下培养5-7d，得到平板形态照片如图1所示，单菌落照片如图2所示，孢子链和气生的形态如图3所示。

将菌株JCP1-7接种于测试培养基中，观察其生化反应特征。结果显示，利用该菌株具有明胶液化、牛奶凝固并胨化的特征，并且略有褐色素；产生硫化氢和类黑色素；在纤维素上有轻微生长。

结合菌落形态和菌丝微观形态照片，以及生化特征，菌株JCP1-7初步鉴定为林肯链霉菌。

提取菌株的基因组DNA，以细菌通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)和1492R(5-TACGGCTACCTTGACGACTT-3)。以菌株JCP1-7的基因组DNA为模板，PCR扩增后经电泳检测，测序，得到16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。将所得的序列结果在NCBI中进行Blast比对，进行进化树构建。得到序列比对结果结合形态和生化特征，显示该菌株属于确定为林肯链霉菌(Streptomyces lincolnensis)。

将上述菌株于2020年12月17日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号：CGMCC No.21377。

2、林肯链霉菌JCP1-7释放的挥发性物质的检测分析

将林肯链霉菌JCP1-7划线接种于高氏合成一号培养基上，28℃培养7d，用无菌水洗下孢子，将混合物经三层擦镜纸过滤，得到孢子悬浮液，最后用无菌水将其稀释，使孢子浓度为1×10

培养了14d的三角瓶送样于上海微谱化工服务技术有限公司用于GC-MS分析，采用顶空固相微萃取的方法分别吸附挥发性物质进行测定。确定菌株JCP1-7的挥发性物质成分。

结果如表1和图4所示，林肯链霉菌JCP1-7产生的挥发性物质中检测到28种挥发性物质成分，主要含有醇类、有机酸酯类、萜烯类等。其中二甲萘烷醇的相对含量最高，为34.047％，其次是八氢萘化合物、四甲基乙烯烷类物质、2-甲基丁酸甲酯和2-甲基异茨醇，其相对含量分别为13.050％、10.683％、6.217％和4.059％。

表1 JCP1-7产生的挥发性物质的成分分析

3、林肯链霉菌JCP1-7挥发性物质的抑菌效果

采用平皿对扣法测定菌株JCP1-7产生的挥发性物质对桃褐腐菌丝生长的影响。

用接种环蘸取待测拮抗菌接种于高氏一号培养基上，培养3d待其定殖后，取活化7d的桃褐腐菌饼接种于另一PDA平板中央，两个平板对扣密封，28℃恒温培养箱中培养。每个处理3个重复，以只接种褐腐病菌的PDA平板和不做任何处理的高氏一号平板对扣为对照。培养24h后，每12h观察一次，测量菌落直径直到96h。继续培养至7d时，再次测量菌落直径并计算菌丝生长抑制率。

结果如图5所示，菌株JCP1-7产生的挥发性物质对桃褐腐菌产生了较强的抑菌作用。

4、林肯链霉菌JCP1-7挥发性物质的控病效果

采用离体果实法测定林肯链霉菌JCP1-7对桃褐腐病的控病效果。

在倒入高氏一号培养基的的一次性灭菌培养皿(70mm)中涂布接种菌株JCP1-7，对照为仅倒入高氏一号培养基，28℃恒温倒置培养5d，待菌株定殖后去掉培养皿盖放于塑料培养箱底部。迅速放入有孔的隔板以保证菌株的挥发性产物能作用于桃果实，隔板上层放置无机械外伤，无病虫药害，大小成熟度等外观基本一致的果实12个。每个果实的处理方法如下：用无菌水进行清洗，在超净工作台中将果实放于75％酒精中消毒2min，再用无菌水漂洗3次后晾干。在每个桃果实腰部的阳面和阴面选取两点，用直径6mm的无菌打孔器打孔3mm深，造成人工伤口，用灭菌滤纸将伤口多余的桃汁液吸干。取直径4mm的桃褐腐病菌菌饼，菌丝面贴放于果实伤口上。塑料培养箱用透明盖子密封后放置在30℃、湿度60％的恒温培养箱中暗培养3d，每24h观察桃果实发病情况和测量病斑的横径和纵径，按椭圆形面积公式计算病斑面积，并计算抑制率。

离体接种试验表明，接种48h后，经JCP1-7处理的病斑扩展抑制率为25.47％；接种72h后，对照组的病斑已经完全覆盖桃果的一侧面，病斑上有大量的孢子，呈现灰褐色。

用血球计数板对桃果实病斑上的褐腐病菌进行孢子量的计算：在72h时用无菌棉签将果实上产生的孢子轻轻洗到20mL无菌蒸馏水中，双层纱布过滤孢子悬浮液后，使用血球计数板和光学显微镜测定桃褐腐菌株的产孢量。确定JCP1-7菌株对桃褐腐病的离体果实上控制效果。

结果显示，对照组的果实孢子量为1.05×10

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 西南大学

<120> 一种可防治桃褐腐病的林肯链霉菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1396

<212> DNA

<213> Streptomyces lincolnensis

<400> 1

cttaccatgc aagtcgaacg atgaaccact tcggtgggga ttagtggcga acgggtgagt 60

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