编辑小麦感病基因植株获得及在抗病品种培育中的应用

技术领域

本发明属于抗病品种培育技术领域，尤其涉及一种编辑小麦感病基因植株获得及在抗病品种培育中的应用。

背景技术

目前，小麦作为种植最广泛的禾谷类作物之一，为全球超过25亿人口提供主食(http://www.fao.org/faostat/)。小麦条锈菌、秆锈菌和叶锈菌三种锈菌引起的小麦锈病，是小麦生产上最为臭名昭著的病害(McIntosh et al.，1995；Ellis et al.，2014)。在世界范围内普遍发生和流行，造成严重的产量损失，严重威胁着小麦生产和安全(Chen etal.，2014；Park et al.，2015；Han and Kang.，2018)。种植抗病品种是预防小麦锈病最经济、有效、环保的策略。尽管育种家已经开发了大量的抗病基因，但多数是小种特异性抗性基因，抗病持久性是有限的。并且小麦锈病小种防控中最大的障碍是新的毒性变异小种的不断出现(Fu et al.， 2009；Zhao et al.，2013；Wang et al.，2016)。因此，培育广谱抗锈的小麦品种仍然面临着一定的挑战。严重时在小麦生产上甚至造成90％以上的产量损失(Ellis et al.，2014)。另外，要生产足够的小麦以满足不断增长的人口的需求，气候变化及其相关的干旱和高温压力，以及新出现的降低产量的病害，都对小麦生产和全球粮食安全构成了巨大的挑战。因此，如何是小麦能够兼顾生产的需求又能抵抗锈菌的侵害，是抗病育种的关键。

植物感病基因对病原菌的成功入侵必不可少，并且在植物与病原菌之间建立的亲和互作所必须的。已经报道的感病基因主要有这三个感病机制，(1)能够帮助病原菌识别和侵入寄主，比如，mlo(感白粉基因)；(2)对于病菌的生长和增殖是有帮助的，比如SWEET家族基因。(3)免疫信号的负调控因子。破坏这些感病基因可以干扰寄主和病原菌的亲和互作，从而赋予植物广谱和持久抗病的能力。近些年来，通过基因操作编辑一些重要作物上的感病基因，已经实现了抗病性的提升。最近的一些研究利用CRISPR基因编辑技术实现了无转基因的感病基因编辑。目前，通过破坏S基因在多种重要的经济作物上实现了广谱抗病性。

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)小麦感基因的发掘及利用是能够给与小麦作物改良的最为经济有效的措施，利用传统的遗传改良方法筛选耗时较长，如何快速挖掘抗病及其调控基因面临着重大的挑战。

(2)破坏感病基因可以成功干扰病原菌与寄主的亲和互作，利用基因编辑手段实现了破坏S基因在水稻等重要经济作物上的成功编辑，并成功实现了作物的广谱抗性，那么是否能够利用已经鉴定的感病基因在小麦上实现成功编辑？

(3)编辑S基因突变体尽管可以实现作物对病害的广谱抗性，然而多数这种突变体在抗病的潜力下会过度消耗植物生长发育过程中所有的营养，那么如何获得能够兼顾抗病和维持生长的小麦材料呢？

解决上述技术问题的难度：利用RNAi技术创制了初步鉴定到的感病基因 TaRIPK1的基因沉默植株，并对不同遗传背景的TaRIPK1-RNAi植株进行表型鉴定，证实了TaRIPK1的RNAi植株表现出对条锈菌的抗性从野生型的感病转变为高抗或者近免疫的改变。接着通过构建串联3个gRNAs的 CRISPR-Cas9-gRNAs载体，然后创制基因编辑的小麦材料，从而实现对感病基因所介导的创制小麦抗锈的新型材料的获得。

解决上述技术问题的意义：通过对TaRIPK1感病基因的研究为阐明小麦感病基因的生物学功能增添新内容，并为小麦的分子改良提供有益的理论指导和基因资源，揭示小麦与条锈菌互作中TaRIPK1感病基因的功能，为抗锈品种的合理利用及遗传改良和条锈病的持久控制提供理论依据和技术支撑。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种编辑小麦感病基因植株获得及在抗病品种培育中的应用。

本发明是这样实现的，一种抗病基因，所述抗病基因为TaRIPK1基因， TaRIPK1基因在小麦中有B，D和A三个拷贝，编码ORF序列为SEQ ID NO： 1-SEQ ID NO：3。

本发明的另一目的在于提供一种所述抗病基因在小麦抗条锈病和叶锈病品种同时改良中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种所述抗病基因在同时改良小麦抗条锈病和叶锈病在小麦抗病品种培育中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种所述抗病基因在同时改良小麦抗条锈病和叶锈病在农作物抗病品种培育中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种所述抗病基因的筛选方法，所述抗病基因的筛选方法包括以下步骤：

第一步，利用基因枪介导的遗传转化的方法，对初步鉴定到的感病基因 TaRIPK1进行沉默，获得了两个遗传背景的小麦材料的TaRIPK1的RNAi植株，对其表型进行筛选鉴定，发现获得的TaRIPK1的RNAi植株产生了显著的抗病反应；

第二步，明确感病基因TaRIPK1功能后，通过CRISPR-Cas9基因编辑技术，获得TaRIPK1编辑的小麦转基因植株，并对其表型进行最终的鉴定发现， TaRIPK1编辑植株对条锈菌主要流行小种和叶锈菌田间流行小种均有抗性，说明利用小麦中的感病基因TaRIPK1在小麦与锈菌互作中具有相同的功能。

本发明的另一目的在于提供一种由所述抗病基因编辑的植株。

进一步，所述植株的创制方法包括：

第一步，RNA靶点设计：根据小麦TaRIPK1基因的基因组序列和CRISPR- Cas9技术设计靶点的要求，设计了5个含有末端含有NGG序列的并在小麦Ta RIPK1基因B，D和A上同时含有的gRNA序列；

第二步，体外检测酶切活性检测，按照活性检测的结果做种选择gRNA1，g RNA3和gRNA5；

第三步，通过体外塔桥的方式将gRNA串联构建到基因编辑载体VK005上；

第四步，农杆菌介导小麦愈伤组织遗传转化：把第三步构建好的CRSPR-C as9-gRNAs载体转化受体品种Fielder中，获得了转CRSPR-Cas9-gRNAs的阳性植株。

第五步，对转基因阳性植株后代进行检测及测序分析，获得了TaRIPK1 A， B和D上都成功编辑的突变体植株。

进一步，所述第一步gRNA序列为gRNA1-ATTGTATTAATATCACCAGG G，gRNA2-CAATAAGATACACTTATAAGG，gRNA3-ATCTGTAGAATCAAG ACAAGG，gRNA4-TCCACACAATAGCCATAAAGG，gRNA5-TCAAGGTAAT TGTAGACAAGG。

进一步，所述第一步中靶位点设计在第二和第三个外显子上。

进一步，通过检测分析发现，在第五步中，靶定成功的gRNA3位于第三个外显子上；gRNA序列为：

gRNA3-ATCTGTAGAATCAAGACAAGG。

结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：在小麦中有B，D和A三个拷贝，每个拷贝的序列如SEQ ID NO：1-3所示。TaRIPK1 在A，B和D三个拷贝ORF全长均为1206bp，其所编码的氨基酸序列均为401 个氨基酸。小麦TaRIPK1基因TaRIPK1-6B，TaRIPK1-6D和TaRIPK1-6A编码 ORF序列为SEQ ID NO：1-3。小麦TaRIPK1基因TaRIPK1-6B，TaRIPK1-6D 和TaRIPK1-6A编码氨基酸序列为SEQ ID NO：4-6。该基因能够被锈菌的关键致病因子septum-promoting GTP-bindin g protein 1操纵和利用。本发明采用基因枪介导的遗传转化获得了两个遗传背景的TaRIPK1的RNAi突变体。本发明采用农杆菌介导的遗传转化方法，利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，获得了TaRIPK1的基因编辑植株。接种小麦条锈菌发现两个遗传背景的TaRIPK1 RNAi 植株菌对条锈菌毒性小种CYR32有显著抗性。对TaRIPK1基因编辑技术进行抗病性鉴定，结果发现TaRIPK1基因编辑植株抗病性显著提升。小麦TaRIPK1基因是作为感病基因参与到小麦感条锈病中，该基因的小麦编辑植株对小麦条锈菌和叶锈菌主要的流行小种抗性显著提升，可以用于小麦抗锈病遗传改良的种质新材料。

本发明利用CRISPR-Cas9基因编辑技术同时编辑小麦中的TaRIPK1在小麦上的三个等位基因，经过对Cas-OFFinder预测的可能脱靶基因的检测发现， TaRIPK1基因编辑植株未有脱靶到其它基因的可能，因此，成功获得了TaRIPK1 基因敲除突变体植株。对TaRIPK1基因敲除突变体接种条锈菌主要优势小种和叶锈菌发现，其对条锈和叶锈菌表现出广谱抗性，且对主要的农艺性状评估结果证实TaRIPK1基因敲除突变体依然维持了主要的农艺性状。TaRIPK1基因敲除突变体和野生型在条锈菌发病严重的田块依然表现出对田间条锈菌群体的抗性，且主要的农艺性状与野生型Fielder并无差异。因此，获得了具有潜在防控小麦条锈病潜力小麦植株。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的用于小麦抗条锈病和叶锈病品种改良的感病基因的筛选获得方法流程图。

图2是本发明实施例提供的用于小麦抗锈病品种改良的TaRIPK1基因编辑植株创制方法流程图。

图3是本发明实施例提供的TaRIPK1 RNAi植株(水源11遗传背景)对条锈菌的抗性分析示意图。

图4是本发明实施例提供的TaRIPK1 RNAi植株(1376遗传背景)对条锈菌的抗性分析示意图。

图5是本发明实施例提供的TaRIPK1三个拷贝的cDNA序列比对分析示意图。

图6是本发明实施例提供的TaRIPK1三个拷贝的蛋白序列比对分析示意图。

图7是本发明实施例提供的用于编辑小麦基因TaRIPK1的编辑载体 CRISPR-Cas9示意图。

图8是本发明实施例提供的TaRIPK1-CRISPR-Cas9-gRNAs载体示意图。

图9是本发明实施例提供的TaRIPK1基因引导RNA(gRNA)序列及体外活性示意图。

图10是本发明实施例提供的农杆菌介导的TaRIPK1-CRISPR-Cas9-gRNAs 转化获得TaRIPK1转基因植株的过程图。

图11是本发明实施例提供的TaRIPK1转基因植株PCR检测结果示意图。

图12是本发明实施例提供的TaRIPK1转基因测序分析结果示意图。

图13是本发明实施例提供的TaRIPK1基因编辑植株中的可能的脱靶检测示意图。

图14是本发明实施例提供的TaRIPK1基因编辑植株对条锈菌主要流行小种表现出广谱抗性示意图。

图15是本发明实施例提供的TaRIPK1基因编辑植株和野生型植株接种叶锈菌表型示意图。

图16是本发明实施例提供的TaRIPK1基因编辑植株维持了主要的农艺性状示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种编辑小麦感病基因植株获得及在抗病品种培育中的应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。

本发明利用CRISPR-Cas9编辑小麦感病基因TaRIPK1同时改良小麦抗条锈病和叶锈病，用于小麦抗锈病品种改良的小麦感病基因为TaRIPK1，其编码的蛋白是典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，TaRIPK1含有蛋白激酶典型的ATP结合位点，活化环和保守的Ser/Thr蛋白激酶保守结构域；

TaRIPK1的在小麦B，D和A染色体上各有1个拷贝，其所编码ORF序列为SEQ ID NO：1-3。

TaRIPK1的在小麦B，D和A染色体所编码氨基酸序列为SEQ ID NO：4-6。

用于编辑TaRIPK1基因的引导RNA序列为SEQ ID NO：7-9。

如图1所示，本发明提供的用于小麦抗条锈病和叶锈病品种改良的感病基因的筛选获得方法包括以下步骤：

S101，利用基因枪介导的遗传转化的方法，对初步鉴定到的感病基因 TaRIPK1进行沉默，最终获得了两个遗传背景的小麦材料的TaRIPK1的RNAi 植株，对其表型进行筛选鉴定，发现获得的TaRIPK1的RNAi植株产生了显著的抗病反应；

S102，明确感病基因TaRIPK1功能后，通过CRISPR-Cas9基因编辑技术，获得TaRIPK1编辑的小麦转基因植株，并对其表型进行最终的鉴定发现， TaRIPK1编辑植株对条锈菌主要流行小种和叶锈菌田间流行小种均有抗性，说明利用小麦中的感病基因TaRIPK1在小麦与锈菌互作中具有相同的功能。

如图2所示，本发明提供的用于小麦抗锈病品种改良的TaRIPK1基因编辑植株创制方法包括如下步骤：

S201，RNA靶点设计：根据小麦TaRIPK1基因的基因组序列和CRISPR-C as9技术设计靶点的要求，设计了5个含有末端含有NGG序列的并在小麦TaRI PK1基因B，D和A上同时含有的guide RNA(gRNA)序列，其序列为gRNA 1-ATTGTATTAATATCACCAGGG，gRNA2-CAATAAGATACACTTATAAGG， gRNA3-ATCTGTAGAATCAAGACAAGG，gRNA4-TCCACACAATAGCCATAAAGG，gRNA5-TCAAGGTAATTGTAGACAAGG；

S202，体外检测酶切活性检测，按照活性检测的结果做种选择gRNA1，gR NA3和gRNA5；

S203，通过体外塔桥的方式将gRNA串联构建到基因编辑载体VK005上；

S204，农杆菌介导小麦愈伤组织遗传转化：把S203构建好的CRSPR-Cas9- gRNAs载体转化受体品种Fielder中，获得了转CRSPR-Cas9-gRNAs的阳性植株。

S205，对转基因阳性植株后代进行检测及测序分析，最终获得了TaRIPK1 B，D和A上都成功编辑的突变体植株。

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的描述。

本发明的利用CRISPR-Cas9编辑小麦感病基因TaRIPK1其位于6B染色体上编码ORF序列为SEQ ID NO：1。

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本发明的利用CRISPR-Cas9编辑小麦感病基因TaRIPK1其位于6D染色体上编码ORF序列为SEQ ID NO：2。

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本发明的利用CRISPR-Cas9编辑小麦感病基因TaRIPK1其位于6A染色体上编码ORF序列为SEQ ID NO：3。

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本发明的利用CRISPR-Cas9编辑小麦感病基因TaRIPK1其位于6B染色体上编码氨基酸序列为SEQ ID NO：4。

Met Gly Cys Ser Pro Phe Phe Cys Tyr Lys Ser Gly Ala Thr Arg Gln GlnIle Ser Thr His Thr Glu Asp Leu Pro Gly Asp Ile Asn Thr Ile Arg Tyr Thr TyrLys Glu Leu Ala Arg Ala Thr Glu Asn Phe Asn Pro Ser Asn Lys Ile Gly Glu GlyGly Phe Gly Ser Val Tyr Lys Gly Arg Leu Arg Asn Gly Lys Leu Ile Ala Val LysVal Leu Ser Val Glu Ser Arg Gln Gly Leu Lys Glu Phe Leu Asn Glu Leu Met SerIle Ser Asn Ile Ser His Gly Asn Leu Val Ser Leu Tyr Gly Tyr Cys Val Glu GlyAsn Gln Arg Ile Leu Val Tyr Asn Tyr Leu Glu Asn Asn Ser Leu Ala Gln Thr LeuLeu Gly Ser Gly Arg Ser Asn Ile Gln Phe Asn Trp Arg Ser Arg Val Asn Ile CysLeu Gly Ile Ala Arg Gly Leu Ala Tyr Leu His Asp Asp Val Asn Pro His Ile ValHis Arg Asp Ile Lys Ala Ser Asn Ile Leu Leu Asp Lys Asp Leu Thr Pro Lys IleSer Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Leu Pro Pro Asn Ala Ser His Ile Ser Thr ArgVal Ala Gly Thr Leu Gly Tyr Leu Ala Pro Glu Tyr Ala Ile Arg Gly Gln Val ThrArg Lys Ser Asp Val Tyr Ser Phe Gly Val Leu Leu Leu Glu Ile Val Ser Gly ArgSer Asn Thr Ser Ser Arg Leu Pro Tyr Glu Asp Gln Ile Leu Leu Glu Lys Phe ProGlu Val Thr Asn Gly Val Leu Leu Leu Gln Thr Trp Met Tyr Tyr Glu Gln Gly AspLeu Ala Lys Ile Ile Asp Ser Ser Ala Gly Asp Asp Leu Asp Ile Glu Gln Ala CysArg Phe Leu Lys Val Gly Leu Leu Cys Thr Gln Asp Val Thr Arg His Arg Pro ThrMet Ser Thr Val Val Ser Met Leu Thr Gly Glu Lys Asp Val Asp Ser Glu Lys IleSer Lys Pro Ala Thr Ile Ser Asp Phe Met Asp Leu Lys Ile Arg Ser Met Arg ArgGlu Asn Asn Ile Ala Phe Ala Ser Ser Ser Thr Leu Leu Ser Thr Ile Met Ala HisSer Ser Pro Leu Leu Ser Gln Glu Thr Thr Gln Ala Ser Ile Thr Phe Thr Ala IleSer Glu Arg Glu

本发明的利用CRISPR-Cas9编辑小麦感病基因TaRIPK1其位于6D染色体上编码氨基酸序列为SEQ ID NO：5。

Met Gly Cys Ser Pro Phe Phe Cys Tyr Lys Ser Gly Ala Thr Arg Gln GlnIle Ser Thr His Thr Glu Asp Leu Pro Gly Asp Ile Asn Thr Ile Arg Tyr Thr TyrArg Glu Leu Ala Arg Ala Thr Glu Asn Phe Asn Pro Ser Asn Lys Ile Gly Glu GlyGly Phe Gly Ser Val Tyr Lys Gly Arg Leu Arg Asn Gly Lys Leu Ile Ala Val LysVal Leu Ser Val Glu Ser Arg Gln Gly Leu Lys Glu Phe Leu Asn Glu Leu Met SerIle Ser Asn Ile Ser His Gly Asn Leu Val Ser Leu Tyr Gly Tyr Cys Val Glu GlyAsn Gln Arg Ile Leu Val Tyr Asn Tyr Leu Glu Asn Asn Ser Leu Ala Gln Thr LeuLeu Gly Ser Gly Arg Ser Asn Ile Gln Phe Asn Trp Arg Ser Arg Val Asn Ile CysLeu Gly Ile Ala Arg Gly Leu Ala Tyr Leu His Asp Asp Val Asn Pro His Ile ValHis Arg Asp Ile Lys Ala Ser Asn Ile Leu Leu Asp Lys Asp Leu Thr Pro Lys IleSer Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Leu Pro Pro Asn Ala Ser His Ile Ser Thr ArgVal Ala Gly Thr Leu Gly Tyr Leu Ala Pro Glu Tyr Ala Ile Arg Gly Gln Val ThrArg Lys Ser Asp Val Tyr Ser Phe Gly Val Leu Leu Leu Glu Ile Val Ser Gly ArgSer Asn Thr Ser Ser Arg Leu Pro Tyr Glu Asp Gln Ile Leu Leu Glu Lys Phe ProGlu Val Thr Asn Gly Val Leu Leu Leu Gln Thr Trp Met Tyr Tyr Glu Gln Gly AspLeu Ala Lys Ile Ile Asp Ser Ser Ala Gly Asp Asp Met Asp Ile Glu Gln Ala CysArg Phe Leu Lys Val Gly Leu Leu Cys Thr Gln Asp Val Thr Arg His Arg Pro ThrMet Ser Thr Val Val Ser Met Leu Thr Gly Glu Lys Asp Val Asp Ser Glu Lys IleSer Lys Pro Ala Thr Ile Ser Asp Phe Met Asp Leu Lys Ile Arg Ser Met Arg ArgGlu Asn Asn Ile Ala Phe Ala Ser Ser Ser Thr Leu Leu Ser Thr Ile Met Ala HisSer Ser Pro Leu Leu Ser Gln Glu Thr Thr Gln Ala Ser Ile Thr Phe Thr Ala IleSer Glu Arg Glu

本发明的利用CRISPR-Cas9编辑小麦感病基因TaRIPK1其位于6A染色体上编码氨基酸序列为SEQ ID NO：6。

Met Gly Cys Ser Pro Phe Phe Cys Tyr Lys Ser Gly Ala Thr Arg Gln GlnIle Ser Thr His Thr Glu Asp Leu Pro Gly Asp Ile Asn Thr Ile Arg Tyr Thr TyrLys Glu Leu Ala Arg Ala Thr Glu Asn Phe Asn Pro Ser Asn Lys Ile Gly Glu GlyGly Phe Gly Ser Val Tyr Lys Gly Arg Leu Arg Asn Gly Lys Leu Ile Ala Val LysVal Leu Ser Val Glu Ser Arg Gln Gly Leu Lys Glu Phe Leu Asn Glu Leu Met SerIle Ser Asn Ile Ser His Gly Asn Leu Val Ser Leu Tyr Gly Tyr Cys Val Glu GlyAsn Gln Arg Ile Leu Val Tyr Asn Tyr Leu Glu Asn Asn Ser Leu Ala Gln Thr LeuLeu Gly Ser Gly Arg Ser Asn Ile Gln Phe Asn Trp Arg Ser Arg Val Asn Ile CysLeu Gly Ile Ala Arg Gly Leu Ala Tyr Leu His Asp Asp Val Asn Pro His Ile ValHis Arg Asp Ile Lys Ala Ser Asn Ile Leu Leu Asp Lys Asp Leu Thr Pro Lys IleSer Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Leu Pro Pro Asn Ala Thr His Ile Ser Thr ArgVal Ala Gly Thr Leu Gly Tyr Leu Ala Pro Glu Tyr Ala Ile Arg Gly Gln Val ThrArg Lys Ser Asp Val Tyr Ser Phe Gly Val Leu Leu Leu Glu Ile Val Ser Gly ArgSer Asn Thr Ser Ser Arg Leu Pro Tyr Glu Asp Gln Ile Leu Leu Glu Lys Phe ProGlu Val Thr Asn Gly Val Leu Leu Leu Gln Thr Trp Met Tyr Tyr Glu Gln Gly AspLeu Ala Lys Ile Ile Asp Ser Ser Ala Gly Asp Asp Leu Asp Ile Glu Gln Ala CysArg Phe Leu Lys Val Gly Leu Leu Cys Thr GlnAsp Val Thr Arg His Arg Pro ThrMet Ser Thr Val Val Ser Met Leu Thr Gly Glu Lys Asp Val Asp Ser Glu Lys IleSer Lys Pro Ala Thr Ile Ser Asp Phe Met Asn Leu Lys Ile Arg Ser Met Arg ArgGlu Asn Asn Ile Ala Phe Ala Ser Ser Ser Thr Leu Leu Ser Thr Ile Met Ala HisSer Ser Pro Leu Leu Ser Gln Glu Thr Thr Gln Ala Ser Ile Thr Phe Thr Thr IleSer Glu Arg Glu

本发明的用于编辑TaRIPK1基因的引导RNA序列gRNA1为SEQ ID NO： 7。attgtattaatatcaccaggg

本发明的用于编辑TaRIPK1基因的引导RNA序列gRNA3为SEQ ID NO： 8。atctgtagaatcaagacaagg

本发明的用于编辑TaRIPK1基因的引导RNA序列gRNA9为SEQ ID NO： 9。tcaaggtaattgtagacaagg

本发明植物优选单子叶植物能够被小麦条锈病菌成功侵染定制的禾谷类作物，特别优选小麦。

本发明实施例提供利用CRISPR-Cas9编辑小麦感病基因TaRIPK1同时改良小麦抗条锈病和叶锈病包括以下步骤：

(1)获得体外转录的gRNAs，先合成T7-gRNA-FPg和gRNA-RP的引物，利用solidPfuMix(唯尚立德)试剂盒说明书的体系加入如下反应体系(如下所示)，经过PCR程序获得了gRNAs的PCR产物，然后将gRNAs通过搭桥的方式构建到含有Cas9酶切位点的片段上。

(2)对获得产物按照如下反应体系加入进行酶切活性检测，其中还包括标准的阳性对照阴性对照的标准品也是同样反应。充分混合均匀后，置于PCR仪中，设置37℃30min，65℃5min，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测，依照阳性和阴性对照标准品对gRNAs的活性进行评估。选择体外活性最高的构建TaRIP K1-CRISPR/Cas9载体的构建。反应体系如下：

(3)以Fielder品种为受体品种通过农杆菌介导的遗传转化转化小麦未成熟幼胚，然后经过分化，筛选，再生和生根，最终获得再生植株。

(4)检测TaRIPK1再生植株是否为转基因阳性的植株，本发明通过PCR 检测分析了已经获得的再生植株是否含有Cas9基因(片段)，Hyg和35S三个元件。

检测引物如下：

(5)进一步分析这两个line是否为基因编辑成功的株系，本发明对其后代持久进行这三个基因的检测，对T2代植株进行分A，B和D，三个拷贝分别进行测序分析。

(6)明确TaRIPK1基因编辑植株对条锈菌的抗性，选择在小麦受体品种F ielder上表现毒性的主要流行小种CYR34，CYR32和CYR33接种编辑植株和野生型植株。

(7)脱靶情况分析，本发明通过Cas-OFFinder(http://www.rgenome.net/ca s-offinder/)(Bae et al.,2014)对三个gRNA可能的脱靶基因进行了分析，通过检测野生型和TaRIPK1编辑植株中这些基因的差异，并进行测序分析。

(8)明确TaRIPK1基因编辑植株对叶锈菌的抗性，通过对TaRIPK1基因编辑植株接种叶锈菌，叶锈菌菌株使用在小麦野生型品种Fielder上表现毒性的 SHTK菌株。

本发明实施例提供的利用CRISPR-Cas9编辑小麦感病基因TaRIPK1同时改良小麦抗条锈病和叶锈病，选择在小麦受体品种Fielder上表现毒性的主要流行小种CYR34，CYR32和CYR33，接种这三种条锈菌后TaRIPK1基因编辑较野生型(Fielder)对条锈菌的抗性显著增强，在野生型植株叶片表面产生大量的孢子堆(UR)，而TaRIPK1基因编辑的叶片表面都产生了大量过敏性坏死反应(H R)，明显抗病性增强。此外，接种CYR34，CYR32和CYR33三种小种14d 时，TaRIPK1基因编辑中的条锈菌的生物量较野生型减少了40.87％，48.14％和60.75％。以上结果表明，TaRIPK1基因编辑植株对条锈菌表现出明显抗性，抗性水平从野生型的高感转变为高抗，并且TaRIPK1基因编辑植株对条锈菌主要流行小种的广谱抗性。

本发明通过对TaRIPK1基因编辑植株接种叶锈菌，叶锈菌菌株使用在小麦野生型品种Fielder上表现毒性的SHTK菌株。接种后放置到保湿箱内黑暗保湿 24h，然后放置在16h光照的20℃，8h黑暗的18℃的生长培养箱内。待接种后12d观察产孢情况，并采取接种的DNA样品对叶锈菌的生物量进行检测。表型鉴定结果显示，TaRIPK1基因编辑植株对叶锈菌SHTK(Pt)变现成明显抗性， TaRIPK1基因编辑植株叶片表面的叫野生型产生了典型的过敏性坏死反应 (HR)，叶片表面产生了零星孢子堆，相反野生型植株Fielder表面未有HR反应，且产生了大量的孢子堆。同时，本发明对接种叶锈菌的TaRIPK1基因编辑植株和野生型植株的锈菌的生物量进行了检测分析，结果发现TaRIPK1基因编辑植株接种叶锈菌(Pt)后叶锈菌的生物量较野生型显著减少。另外，通过ImageJ 分析了叶片表面的孢子堆的数量发现，接种叶锈菌的TaRIPK1基因编辑植株比野生型叶片表面的孢子堆显著减少。由此可以证明，TaRIPK1基因编辑植株除了对条锈菌有抗性外，对叶锈菌也有较强的抗性，其所产生抗性的机理是由于锈菌的分泌蛋白能否与寄主植物的感病基因互作，通过打断其建立的互作才使得寄主产生广谱抗性。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

<110>西北农林科技大学

<120>抗病基因、筛选方法、植株及在抗病品种培育中的应用

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