公开/公告号CN113135973B
专利类型发明专利
公开/公告日2022-08-09
原文格式PDF
申请/专利权人 泰安市炜创生物技术中心;
申请/专利号CN202110494882.1
发明设计人 周炜强;
申请日2021-05-07
分类号C07J9/00(2006.01);C12P33/06(2006.01);
代理机构济南泉城专利商标事务所 37218;
代理人牛芳
地址 271026 山东省泰安市岱岳区大汶口镇东武村立交桥北50米
入库时间 2022-09-06 00:41:19
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2022-08-09
授权
发明专利权授予
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,涉及熊去氧胆酸的制备方法,具体涉及一种从猪去氧胆酸合成熊去氧胆酸的方法。
背景技术
熊去氧胆酸(Ursodexycholic acid)简称UDCA,是熊胆的主要成分,其化学名称为(3α,7β)-二羟基-5β胆烷酸。医学上用于增加胆汁酸分泌,并使胆汁成分改变,降低胆汁中胆固醇及胆固醇脂,有利于胆结石中的胆固醇逐渐溶解,用于治疗胆结石、胆汁淤积性肝病、脂肪肝、各型肝炎、中毒性肝障碍、胆囊炎、胆道炎和胆汁性消化不良、胆汁返流性胃炎、眼部疾病等。自从20世纪80年代,发现熊去氧胆酸具有有效溶解胆固醇性结石作用以来,不断有新的研究显示熊去氧胆酸在利胆、护肝中具有积极的作用。近年来,国外报道了UDCA还可用于治疗慢性肝炎和肝移植后排斥反应。随着临床研究的不断进步,人们发现熊去氧胆酸在促进免疫调节、治疗冠心病等方面也有积极作用。因此,随着研究的深入,熊去氧胆酸的药用价值越来越受到人们的重视,对熊去氧胆酸的需求量也在逐年升高。但是,天然熊胆的来源日益减少,人们一直在努力寻求除以天然熊胆获取熊去氧胆酸之外的替代方法。早期,熊去氧胆酸是通过从牛、羊胆汁中分离提取的胆酸为起始原料,然后经过复杂的化学方法生产的,其中,制成鹅去氧胆酸后需经氧化还原生成熊去氧胆酸。但是,这一方法步骤多、生产时间长、成本高。
近几年国内UDCA市场增长迅速,随着酶催化技术的逐步推进,目前的UDCA生产工艺开始从化学工艺大范围转到酶催化工艺。从目前公开的技术来看,酶法制备UDCA的原料大部分是鹅去氧胆酸(CDCA)。在各种动物胆汁中,猪胆汁是最常见且产量最大的,自古代开始就被广泛应用于临床,如用猪胆汁治疗急性黄疸型传染性肝炎、百日咳、急性肠炎以及胃溃疡等,均能收到良好的治疗效果。猪胆汁中主要含胆汁酸类、胆色素、粘蛋白、脂类及无机物等,胆汁酸则主要包含猪去氧胆酸(HDCA)、猪胆酸、鹅去氧胆酸、3α-羟基-6-氧-5α-胆烷酸以及胆石酸等,其中猪去氧胆酸约占40%。猪去氧胆酸的来源广泛廉价,成为较理想的原料。现有技术中从HDCA到UDCA的技术基本是全化学法,工艺复杂,成本较高,环境不友好,安全风险大,因此需要开发更加安全简便的生产途径。
发明内容
针对现有技术中的问题,本发明提供一种利用猪去氧胆酸制备熊去氧胆酸的方法,采用化学-酶法以猪去氧胆酸为原料,通过简单的三步反应,实现了UDCA的生产,该方法的工艺简单,成本低,转化率高,后处理更容易,更加环保。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案。
一种利用猪去氧胆酸制备熊去氧胆酸的方法,包括以下步骤:
(1)猪去氧胆酸与琼斯试剂发生氧化反应,分离纯化获得中间体R1:
(2)在3α-类固醇脱氢酶(3α-HSDH)、7β-羟化酶和葡萄糖脱氢酶(GDH)催化,葡萄糖和辅酶I或辅酶II的参与下将中间体R1催化,反应终止后分离纯化获得中间体R2:
(3)中间体R2通过黄鸣龙反应分离纯化后获得熊去氧胆酸:
优选地,步骤(1)中,所述反应在溶液中进行,所述溶液的溶剂为乙酸乙酯或丙酮。
优选地,步骤(1)中,所述分离纯化步骤为:用硅藻土过滤,减压浓缩去除溶剂。
优选地,步骤(2)中,中间体R1:3α-类固醇脱氢酶:7β-羟化酶:葡萄糖脱氢酶:辅酶:葡萄糖的质量比为1:(0.3-1):(0.2-1):(0.1-1):(0.001-0.005):(2-4)。
优选的,步骤(2)中,辅酶I和辅酶II用还原态的代替。
优选地,步骤(2)中,反应在缓冲溶液中进行;中间体R1在溶液中的质量体积浓度为5%-15%。
优选地,步骤(2)中,反应pH为6.5-7.5,反应温度为25℃-37℃。
优选地,步骤(2)中,氧气由空气或富氧空气提供;所述富氧空气的氧气含量为21%-50%。更优选地,通气量为0.5-2vvm。
优选地,步骤(2)中,所述分离纯化步骤为:反应体系中加入等体积乙酸乙酯,质量体积浓度为20%的硅藻土,搅拌后过滤,将滤液分液后收集有机相I;将滤饼和水相合并,再加入首次加入量的乙酸乙酯,搅拌后过滤,将滤液分液,收集有机相II,然后将两次有机相合并后去除溶剂获得中间体R2。
优选地,步骤(3)中,所述分离纯化步骤为:反应体系中加等体积水,然后调pH至2.0,然后用2体积倍的乙酸乙酯萃取两次,合并萃取液后蒸出溶剂获得产物。
本发明具有以下优点:
本发明利用酶催化技术替代了大部分化学反应,将步骤繁琐、条件苛刻、高污染高安全风险的全化学反应转换成化学-酶法,仅保留了条件相对温和的化学反应,极大降低了生产成本,降低了环保压力和安全生产压力;酶反应过程中实现了辅酶NADPH的循环再生,将昂贵的辅酶用量降到了最低,极大降低了生产成本。本发明的制备方法既降低了生产成本,有利于环境保护和生产安全,在实际生产中优势巨大。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明,但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 利用猪去氧胆酸制备熊去氧胆酸
(1)将22 g三氧化铬加入28 mL浓硫酸中,用水稀释至100 mL,得到琼斯试剂;将100g猪去氧胆酸溶于1000mL丙酮中并用琼斯试剂处理,直到获得轻微的永久橙色。将混合物静置10min后,加入少量异丙醇以破坏过量的氧化剂。反应混合物用硅藻土过滤,减压浓缩去除溶剂,得到99.1g产品R1,收率99.1%;
(2)反应体系500mL,往2L三孔烧瓶中加入400mL 0.05M pH 6.8 PBS缓冲液,然后加入50g中间体R1、120g葡萄糖、40mL正己醇、2.5mL Triton X-100、0.1g NADP
(3)将25g中间体R2溶解在500mL一缩二乙二醇中,加入30mL 98%水合肼,加热至120℃,搅拌2h,冷却至80℃,然后加入25g NaOH,升温至200℃反应10h。HPLC检测反应底物R2和产物UDCA的浓度,反应99%以上时结束反应。反应结束后加水500mL,用盐酸调pH至2.0,然后用1000mL乙酸乙酯萃取两次,合并萃取液,然后50℃旋蒸,得到UDCA干粉22.4g,收率89.6%。
实施例2 利用猪去氧胆酸制备熊去氧胆酸
(1)将22 g三氧化铬加入28 mL浓硫酸中,用水稀释至100 mL,得到琼斯试剂。将50g猪去氧胆酸溶于1000mL乙酸乙酯中并用琼斯试剂处理,直到获得轻微的永久橙色。将混合物静置10min后,加入少量异丙醇以破坏过量的氧化剂。反应混合物用硅藻土过滤,减压浓缩去除溶剂,得到48.8g中间体R1,收率97.6%;
(2)反应体系500mL,往2L三孔烧瓶中加入400mL 0.05M pH 7.0 PBS缓冲液,然后加入25g中间体R1、50g葡萄糖、40mL正己醇、2.5mL Triton X-100、0.025g NAD
(3)将20g中间体R2溶解在500mL一缩二乙二醇中,加入25mL 98%水合肼,加热至120℃,搅拌2h,冷却至80℃,然后加入20g NaOH,升温至200℃反应10h。HPLC检测反应底物R2和产物UDCA的浓度,反应99%以上时结束反应。反应结束后加水500mL,用盐酸调pH至2.0,然后用1000mL乙酸乙酯萃取两次,合并萃取液,然后50℃旋蒸,得到UDCA干粉18.4g,收率92%。
实施例3 利用猪去氧胆酸制备熊去氧胆酸
(1)将22 g三氧化铬加入28 mL浓硫酸中,用水稀释至100 mL,得到琼斯试剂。将100g猪去氧胆酸溶于1000mL丙酮中并用琼斯试剂处理,直到获得轻微的永久橙色。将混合物静置10min后,加入少量异丙醇以破坏过量的氧化剂。反应混合物用硅藻土过滤,减压浓缩去除溶剂,得到98.2g产品R1,收率98.2%;
(2)反应体系500mL,往2L三孔烧瓶中加入400mL 0.05M pH 7.4 PBS缓冲液,然后加入75g中间体R1、230g葡萄糖、40mL正己醇、2.5mL Triton X-100、0.3g NADPH,将三孔烧瓶放在25℃恒温水浴锅中,搅拌均匀后调pH 7.4,然后加入50g 3α-HSDH、50g 7β-羟化酶、50g GDH,反应过程中保持温度和pH的稳定,并持续向三孔烧瓶中通入50%富氧空气,空气流量1L/min。反应6h后HPLC检测底物R1和产物R2的浓度,反应超过98%后结束反应,向反应瓶中加入500mL乙酸乙酯,20g硅藻土,搅拌15min后过滤,将滤液分液后收集有机相。将滤饼和水相合并,再加入500mL乙酸乙酯,搅拌15min后过滤,将滤液分液,收集有机相,然后将两次有机相合并,60℃旋蒸,得到中间体R2干粉69.3g,收率92.4%;
(3)将25g中间体R2溶解在500mL一缩二乙二醇中,加入30mL 98%水合肼,加热至120℃,搅拌2h,冷却至80℃,然后加入25g NaOH,升温至200℃反应10h。HPLC检测反应底物R2和产物UDCA的浓度,反应99%以上时结束反应。反应结束后加水500mL,用盐酸调pH至2.0,然后用1000mL乙酸乙酯萃取两次,合并萃取液,然后50℃旋蒸,得到UDCA干粉22.1g,收率88.4%。
机译: 熊去氧胆酸制备中的熊去氧胆酸和酶1的制备方法
机译: 猪去氧胆酸熊去氧胆酸的体内转化及适用于该方法的酶突变体
机译: 使用其的熊去氧胆酸的生产方法以及熊去氧胆酸的叔胺盐