hsCRP检测试剂盒和hsCRP的检测方法

技术领域

本发明涉及体外诊断试剂盒技术领域，特别涉及一种hsCRP检测试剂盒和hsCRP的检测方法。

背景技术

超敏C反应蛋白(hsCRP)是由Tillet和Francis于1930年发现的一种能在钙离子存在时与肺炎链球菌的荚膜C多糖起沉淀反应得到的，hsCRP和CRP在化学本质上无区别，是同一种物质，只是检测方法的下限不同，现在一些高灵敏度的检测方法能检测到≤0.3mg/L的CRP，用这些方法所检测的CRP就称为超敏C反应蛋白。

目前市面上CRP的免疫检测方法，主要有酶联免疫、免疫比浊、荧光免疫层析、化学发光等。酶联免疫：该方法的检测灵敏度较低、线性范围窄、操作过程繁琐，不易实现全自动化，检测时间较长，不利于快速检测，所以不太适合临床应用。

免疫比浊：这是目前CRP主要的检测方法，当CRP抗原与相应抗体在特殊缓冲液中快速形成抗原抗体复合物，使反应液出现浊度，但是免疫学中常因抗原过剩而引起的勾状效应，导致假阳产生。该方法也容易受血脂浓度影响产生假阳性。

荧光免疫层析：将第一抗体固定在NC膜的检测线上，第二抗体标记在荧光微球上并固定于结合物垫中。这种固液相反应本身存在很大的不确定性，如NC膜和结合物垫喷涂不均一、荧光微球释放不完全、层析速度不一致、上下卡壳压紧的松紧程度不一等，这一系列原因，导致干式免疫试纸条的批内精密度通常超过10％，准确度较差，这限制了干式荧光免疫技术的应用。

化学发光：酶促化学发光法包括双抗体夹心法和竞争法。双抗体夹心法是用磁珠做固相载体，其上包被第一抗体，第二抗体标记在酶上，待测物质与表位不同的第一、二抗体形成夹心复合物。竞争法是磁珠上包被抗原，酶上标记检测抗体，待测物与磁珠包被的抗原竞争结合酶标记的检测抗体。化学发光是一种较为先进的免疫学方法，具有高灵敏、高特异、快速、高通量、宽线性范围等特点。

目前CRP化学发光试剂盒大都采用夹心法，特别是在一步法检测中，如果样本中抗原含量太高，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成"夹心复合物"，将出现Hook效应，使所得结果将低于实际的含量而出现假阴性结果。为了解决这种Hook效应引起的CRP检测范围变窄的问题，大多厂家采用预稀释、用酸破坏后碱中和的方式处理样本、或添加一个游离的单抗等方法，这些方法无疑增加了反应时间、对于试剂的稳定性等操作增加了难度。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种hsCRP检测试剂盒和hsCRP的检测方法，旨在扩宽检测范围，同时提高灵敏度和特异性。

为实现上述目的，本发明提出的hsCRP检测试剂盒，采用了酶促竞争法，本发明的原理是用CRP抗原包被固相磁珠，CRP抗体标记碱性磷酸酶，待测物与固相抗原竞争结合酶标记的检测抗体(图1)。样本中待测物浓度越高，与酶标记抗体结合得越多，固相抗原则结合得越少，经过洗涤除去未结合的抗原、抗体，加入AP的发光底物液(AMPPD)，根据竞争关系，此法样本中待测物浓度与发光值成反比。竞争法由于是样本抗原与固相抗原竞争结合酶标抗体，避免了夹心法中过量抗原与酶标抗体结合而不再与固相抗体结合而导致的Hook效应。

另外本发明将CRP抗原包被于磁珠上时，为了避免大分子物质的空间位阻影响包被效果，本发明对磁珠包被工艺进行了改进，采用通过FITC与抗FITC体系进行间接包被的方式(图1)，增加了包被抗原与磁珠的连接臂的长度，因此减弱了空间效应，有利于增加灵敏度。

为了简化检测的操作步骤，同时针对大多数仪器无法准确吸取微量样本的问题，本发明优化了磁珠稀释液的配方，在其中加入适量的适宜浓度的蛋白变性剂SAS以消耗过量的CRP，使本试剂盒在检测时样本无需稀释就可准确定量CRP浓度。

本发明提出的hsCRP检测试剂盒，包括：第一试剂，所述第一试剂包括包被有抗异硫氰酸荧光素抗体的磁珠复合物；第二试剂，所述第二试剂包括标记有异硫氰酸荧光素的CRP抗原复合物；以及第三试剂，所述第三试剂包括酶标记CRP抗体复合物。

可选的实施例中，所述酶标记CRP抗体复合物为碱性磷酸酶标记CRP抗体复合物。

可选的实施例中，所述hsCRP抗原间接地包被在磁珠上，通过异硫氰酸荧光素与抗异硫氰酸荧光素抗体体系进行间接包被。

可选的实施例中，所述第一试剂还包括第一稀释液，所述第一稀释液包括0.05MTris、0.05％吐温-20(v/v)、1％BSA(w/v)、0.9％NaCl(w/v)、0.1％ProCli(v/v)及0.05％SAS(w/v)。

可选的实施例中，所述第一试剂中所述磁珠复合物的浓度为0.1-0.4mg/ml。

可选的实施例中，所述第二试剂还包括第二稀释液，所述第二稀释液包括0.05MTris、3％BSA(w/v)、0.9％NaCl(w/v)及0.1％ProCli(v/v)。

可选的实施例中，所述第二试剂中所述异硫氰酸荧光素标记CRP抗原复合物的浓度为0.08-0.16mg/ml。

可选的实施例中，所述第三试剂还包括第三稀释液，所述第三稀释液包括0.05MTris、0.05％吐温-20(v/v)、1％BSA(w/v)、1mM MgCl

可选的实施例中，所述第三试剂中所述酶标记CRP抗体复合物的稀释比为1:500至1:2000。

本发明还提出了一种hsCRP的检测方法，采用如前所述的hsCRP检测试剂盒，包括以下步骤：

依次加入第一试剂、第二试剂、待测hsCRP样本或hsCRP定标品、及第三试剂，分别孵育、磁分离和清洗后，加入所述底物发光液；

检测所述底物发光液的相对发光强度，并根据相对发光强度计算hsCRP的浓度；

其中，所述第一试剂包括抗异硫氰酸荧光素抗体包被磁珠的复合物，所述第二试剂包括异硫氰酸荧光素标记CRP抗原的复合物，所述第三试剂包括酶标记CRP抗体复合物。

本发明的技术方案至少能够取得以下技术效果：本发明提供的hsCRP检测试剂盒，通过采用合适的技术方法，有效的增加了检测范围、提高了灵敏度，在样本不用稀释的情况下便可进行检测，因此简化了操作步骤。本试剂盒与国外试剂盒相比，相关度高，而且本试剂盒价格低廉，操作简便，性能优良，可在临床上推广使用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。

图1为本发明中采用酶促发光竞争法检测的原理示意图；

图2为是本发明间接竞争法与双抗体夹心法两种方法的对比示意图；

图3为间接方式包被磁珠与直接方式包被磁珠的低值线性对比示意图；

图4为实施例四采用本发明试剂盒与罗氏试剂盒测试结果比对图。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。

实施例1

实施例1涉及一种间接包被磁珠、样本不用稀释的竞争法hsCRP检测试剂盒，包括的组份有：第一试剂、第二试剂、第三试剂、hsCRP定标品。每种组分制备方法如下。

1、第一试剂的制备

(1)磁珠-抗FITC(异硫氰酸荧光素)复合物的制备：取10mg甲苯磺酰基化的磁珠(30mg/ml)，用1ml的0.1M硼酸缓冲液(pH 9.5)清洗3次，然后用该缓冲液和3M硫酸铵重悬磁珠(V

(2)第一稀释液的配制：将0.05％吐温20(v/v)、1％BSA(w/v)、0.9％NaCl(w/v)、0.1％ProCli(v/v)、0.05％SAS(w/v)溶于0.05M Tris(PH7.4)中，搅拌混匀。

(3)用第一稀释液将原始的磁珠-抗FITC复合物稀释至磁珠浓度为0.2mg/ml，得到第一试剂。

2、第二试剂的制备

(1)CRP抗原-FITC复合物的制备：将CRP抗原用0.01mol/L PBS(pH8.0)稀释到浓度为30-40mg/ml；按1mg/ml浓度配制FITC的DMSO溶液，每次交联使用的FITC均应新鲜配制，避光；将蛋白溶液与FITC溶液按照1mg抗原/0.1mg荧光素比例混合，在暗处0～4℃中搅拌8h，充分搅匀；加入5mol/L的NH

(2)第二稀释液的配制：将3％BSA(w/v)、0.9％NaCl(w/v)、0.1％ProCli(v/v)n溶于0.05M Tris(PH7.4)中，搅拌混匀。

(3)采用配制好的第二稀释液将原始的CRP抗原-FITC复合物稀释至0.1mg/ml，得到第二试剂。

3、第三试剂的制备

(1)碱性磷酸酶标记抗体复合物的制备：在150μL的0.1M MES缓冲液(pH6.1)中依次加入，33μL CRP抗体(浓度3mg/ml)、50μL 10mg/ml EDC水溶液(EDC溶液为现配现用)，混匀，常温下活化30min。然后加入150μL碱性磷酸酶溶液(浓度5.0mg/ml)，混匀，常温下避光反应2小时。再加入含1％BSA的0.1M Tris缓冲液(pH7.4)，混匀后常温下封闭30min。加入0.5％磷酸二乙脂于室温下继续反应30min，最后用30KD超滤柱，离心纯化后加入一半体积甘油保存于-20度。

(2)第三稀释液的配制：将0.05％吐温20(v/v)、1％BSA(w/v)、1mM MgCl

(3)采用配制好的第三稀释液将原始的碱性磷酸酶标记抗体复合物稀释1000倍，得到第三试剂。

4、hsCRP定标品的配制

取适量的超纯水，溶解国际标准物质(NIBSC code：85/506)至浓度20mg/l，然后用校准品稀释液将20mg/l梯度稀释为10mg/l、5mg/l、2mg/l、1mg/l、0.5mg/l、0.2mg/l、0.1mg/l、0.05mg/l。

5、实施例1的反应模式

(1)在反应管中依次加入30ul第一试剂、20ul第二试剂，两个试剂反应生成CRP抗原包被的磁珠。

(2)再加入10ul待测hsCRP样本(或hsCRP定标品)、50ul第三试剂，混合均匀，分别37℃孵育5min，此步中CRP抗原包被的磁珠和hsCRP样本(或hsCRP定标品)竞争结合酶标记物。

(3)将上述的反应液进行磁分离，加入400ul清洗液清洗4次，将杂质洗去。

(4)加入300ul底物溶液，混匀后反应1min，检测光电值，仪器将根据内置的校准曲线根据光电值计算出浓度值。

实施例2

实施例2涉及一种双抗体夹心法的hsCRP检测试剂盒，该试剂盒包含的组分与实施例1相同，第一试剂、第三试剂、hsCRP定标品的制备方法同实施例1，只是第二试剂的制备方法和反应模式稍有不同。将实施例1中第二试剂的制备方法中的CRP抗原换为CRP抗体，该抗体与酶标抗体具有不同的抗原表位。

实施例2的反应模式

(1)在反应管中依次加入30ul第一试剂、20ul第二试剂，两个试剂反应生成CRP抗体包被的磁珠。

(2)再加入10ul待测hsCRP样本(或hsCRP定标品)、50ul第三试剂，混合均匀，分别37℃孵育5min，此步中CRP抗体包被的磁珠和hsCRP样本(或hsCRP定标品)与酶标记物反应生成夹心复合物。

(3)将上述的反应液进行磁分离，加入400ul清洗液清洗4次，将杂质洗去。

(4)加入300ul底物溶液，混匀后反应1min，检测光电值，仪器将根据内置的校准曲线根据光电值计算出浓度值。

实施例3

实施例3涉及一种直接方式包被磁珠的hsCRP检测试剂盒，包含的组分有第一试剂、第三试剂、hsCRP定标品。第三试剂、hsCRP定标品制备方法同实施例1。只是第一试剂的制备方法和反应模式稍有不同。将实施例1中第一试剂的制备方法中的抗FITC抗体换为CRP抗原。

实施例3的反应模式：

(1)再加入30ul第一试剂(CRP抗原直接包被磁珠)、10ul待测hsCRP样本(或hsCRP定标品)、50ul第三试剂，混合均匀，分别37℃孵育5min，此步中CRP抗原直接包被的磁珠和hsCRP样本(或hsCRP定标品)竞争结合酶标记物。

(2)将上述的反应液进行磁分离，加入400ul清洗液清洗4次，将杂质洗去。

(3)加入300ul底物溶液，混匀后反应1min，检测光电值，仪器将根据内置的校准曲线根据光电值计算出浓度值。

实施例4

实施例4涉及一种样本预稀释的hsCRP检测试剂盒，该试剂盒包含的组分除了实施例1的全部组分外，还包括样本稀释液。第二试剂、第三试剂、hsCRP定标品的制备方法同实施例1，只是第一试剂稀释液和反应模式稍有不同。该实施例的第一试剂稀释液中不含0.05％SAS(w/v)。

样本稀释液：为0.9％NaCl溶液。

实施例4的反应模式：

(1)hsCRP样本(或hsCRP定标品)预稀释：取10ul样本加入1000ul样本稀释液中。

(2)在反应管中依次加入30ul第一试剂、20ul第二试剂，两个试剂反应生成CRP抗原包被的磁珠。

(3)再加入10ul预稀释后的hsCRP样本(或hsCRP定标品)、50ul第三试剂，混合均匀，分别37℃孵育5min，此步中CRP抗原包被的磁珠和hsCRP样本(或hsCRP定标品)竞争结合酶标记物。

(4)将上述的反应液进行磁分离，加入400ul清洗液清洗4次，将杂质洗去。

(5)加入300ul底物溶液，混匀后反应1min，检测光电值，仪器将根据内置的校准曲线根据光电值计算出浓度值。

实施例1和实施例2制备的试剂盒对定标品进行测试，测试结果参照表1和图2。其中实施例1的高值信噪比高于实施例2，说明实施例1采用间接竞争法的原理，避免了由于双抗体夹心法的HOOK效应导致的线性范围变窄现象。这种方法对扩宽线性范围是有效的。

表1是本发明间接竞争法与双抗体夹心法两种方法的对比数据

实施例1和实施例3制备的试剂盒对低值定标品进行测试，低值线性数据见表2和图3。由于实施例1采用间接的方式进行磁珠的包被，即在磁珠上预先包被抗FITC，抗原再标记FITC，进行反应时，两者形成了磁珠-抗FITC-FITC-抗原复合物，增加了包被抗原与磁珠的连接臂的长度，因此减弱了空间效应，从测试结果可以看出这种方法有效地增加灵敏度、增加低值线性范围内的信噪比。

表2为间接方式包被磁珠与直接方式包被磁珠的低值线性对比数据

实施例1和实施例4制备的试剂盒对定标品进行测试，实验数据见表3所示。实施例1在第一稀释液中加入适量的适宜浓度的蛋白变性剂SAS以消耗样本中过量的CRP，从测试结果可以看出，其线性结果与样本预稀释相同的效果。这样的设计简化了操作步骤，避免了对样本进行稀释，同时也减少了对仪器的依赖。

表3在第一稀释液中加入蛋白变性剂与样本稀释的对比数据

鉴于以上实验结果，与实施例2、3、4相比，实施例1线性范围更宽、灵敏度更高、操作更简便，以下给出了按照本领域中常规的制造及检定规程对实施例1中制备的化学发光检测试剂盒进行检定的数据。

1.检出限的检测

对5份浓度近似检出限的低值样本进行检测，每份样本检测5次，对检测结果按照大小进行排序，符合低于的检出限数值(检出限为0.05mg/L)的检测结果的数量小于或等于3个，说明该试剂盒有较低的检出限，能达到0.05mg/L，数据如表4所示。

表4检出限的检测数据

2.线性检测

取浓度为0mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L定标品，每个定标品平行测试3次。数据表5所示，计算均值和靶值之间的线性相关系数，r＝0.9976，说明该试剂盒的线性范围宽，能达到0.05mg/L～20mg/L。

表5线性检测数据

3.重复性检测

取浓度为1mg/L及10mg/L两个CRP样品，每个样本平行测试20次，计算试剂盒的变异系数，CV都小于8％，结果表明该试剂盒重复性良好。数据表6所示。

表6重复性检测数据

4.临床样本符合性测试

本市一医疗机构提供的200例样本(涵盖整个线性范围)，用本发明试剂盒以及罗氏CRP测试试剂盒分别进行测试，计算试验结果相关性为：R2＝0.981，K值为0.9958，参照图4，说明与罗氏的相关性非常好，能满足实际应用的需求，能准确测定样本中hsCRP浓度。

5.稳定性测试

按照上述实施案例制备同一批次试剂盒，取三盒试剂，一盒放置在2-8℃，一盒放置在37℃恒温箱4天，一盒放置在37℃恒温箱7天。取浓度为1mg/L及10mg/L两个CRP样品，用37℃中放置了4天、7天与放置在2-8℃的试剂测试两个样品，每个平行测试3次，计算37℃中放置4天、7天与放置在2-8℃中的相对偏差。数据如下表7和表8所示，相对偏差都在±10％之内，说明本试剂盒稳定性较好。

表7高值稳定性测试数据

表8低值稳定性测试数据

以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。