鹿角方中鹿角蛋白的制备及其对兔膝软骨细胞的保护作用

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目的：骨关节炎是一类老年人高发的退行性病变，《严氏济生方》中《鹿角丸》是治疗骨关节炎的经典方剂，但是其传统剂型服用量大，给患者带来不便。鹿角方组成参考《鹿角丸》的处方组成，对鹿角方中的鹿角蛋白进行提取工艺优化及酶解工艺优化以提高鹿角蛋白口服生物利用度；通过离体外翻肠囊实验及细胞药效的实验，为鹿角蛋白及鹿角方复方产品口服剂型开发提供药动学实验依据及为其在OA治疗方面提供药效研究基础。
　　方法：水为提取溶剂采用冷凝回流提取鹿角中总蛋白，以蛋白质含量为考察指标，采取L9（34）正交试验，对提取时间、提取次数、液料比进行考察，优选出鹿角蛋白的提取工艺。使用市面上常见的胃蛋白酶、酸性蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶七种蛋白酶对鹿角蛋白进行水解作用，通过酶解物水解度及体外抗氧化活性的测定，选取合适鹿角蛋白酶解的蛋白酶。优选出风味蛋白酶及碱性蛋白酶进行鹿角蛋白双酶解工艺优化，以水解度及蛋白酶解物O2-·抑制率为双目标，通过Box-Behnken试验设计进行鹿角蛋白酶解响应曲面优化。建立大鼠外翻肠囊吸收模型，考察鹿角蛋白酶解前后对总氨基酸、羟脯氨酸、甘氨酸的吸收影响。通过兔膝软骨体外培养，建立IL-1β诱导软骨细胞炎症模型及H2O2诱导氧化损伤模型，评价药物对软骨细胞的保护作用。
　　结果：⑴通过正交试验优化后，选择鹿角蛋白终提取工艺为：提取时间为2h，提取次数为4次，料液比1:10。⑵单酶解实验中，风味蛋白酶酶解物水解度最高，酶解330min后水解度为33.21±9.29％；风味蛋白酶解物·OH清除能力清除能力较强，酶解产物IC50为1.04 mg/mL；碱性蛋白酶酶解物O2-·清除效果最强，酶解产物IC50为1.87mg/mL。⑶通过对鹿角双酶解实验结果进行拟合，得到最优双酶解工艺参数为酶解pH7.5，酶解温度51.6℃，风味蛋白酶：碱性蛋白酶比例为7:3。⑷肠吸收实验中，酶解后的鹿角蛋白的肠吸收液中，Hyp、Gly及总氨基酸的Q120及Ka较同浓度未酶解的鹿角蛋白皆有显著提高（P＜0.01）。⑸浓度为10μg/mL的酶解鹿角蛋白及鹿角方药物都能显著增加IL-1β诱导的软骨细胞的增殖（P＜0.05）。酶解鹿角蛋白及鹿角方对H2O2诱导的细胞氧化损都有很好的保护作用，能显著提高细胞存活率（P＜0.01）。酶解鹿角蛋白及鹿角方药物在100μg/mL的剂量干预下都能显著提高（P＜0.05）IL-1β诱导的软骨细胞内COLⅡ的含量及细胞培养上清中GAG的含量。
　　结论：①通过离体外翻肠囊实验研究，鹿角蛋白经酶解工艺后，可以大幅提高Gly、Hyp及总氨基酸在小肠部位的吸收。②通过离体兔膝软骨培养，鹿角蛋白酶解物及鹿角方都可在一定程度上改善H2O2及IL-1β对兔膝软骨细胞的损伤作用。

著录项

作者
钟琦;
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作者单位

广东药学院;

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授予单位广东药学院;
学科中药学
授予学位硕士
导师姓名崔升淼;
年度 2017
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类动物药;有效成分的分离与提取;
关键词
鹿角蛋白; 药物提取; 酶解工艺; 膝软骨细胞; 保护作用;

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