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海藻糖对阿尔兹海默症中APP代谢的分子机制研究及IL-17对人偏肺病毒感染中免疫细胞表达失衡的影响机制

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第一部分 海藻糖对阿尔茨海默症中APP代谢的分子机制研究

摘 要

PART I TREHALOSE FOR ALZHEIMER'S DISEASE IN MOLECU

?ABSTRACT

ABSTRACT

第一部分 海藻糖对阿尔茨海默症中APP代谢的分子机制研究

前言

神经变性疾病是一类以中枢神经系统的神经元发生进行性损伤及死亡,导致认知及运动功能受损为特征的疾病[1

有研究指出APP代谢受到自噬的调控。自噬是一种溶酶体相关性降解途径,与某些蛋白、细胞器及营养物质的降

海藻糖 (α-D-glucopyranosyl-(1 → 1)-α-D-glucopyranosid

本研究探讨了海藻糖对APP代谢的作用。结果提示在细胞和动物模型中海藻糖可以减少APP和CTF的降解,

第一部分:海藻糖在阿尔茨海默症APP代谢的分子机制研究

1材料

1.1.实验动物

1.2主要材料与仪器

1.3主要试剂配制

1.4主要应用的生物学软件

1.5查询的生物信息学数据库

2方法

2.1细胞培养及药物干预

2.2 Western blotting(蛋白免疫印迹)

2.3小鼠繁殖

2.4小鼠鉴定

2.5小鼠模型建立

2.6 Morris水迷宫行为学实验

2.7免疫组织化学染色

2.7.1摘取脑组织及固定

2.7.2脑组织脱水、包埋及切片

2.7.3免疫组织化学

2.7.4硫磺素S染色

2.8 Aβ40ELISA

2.8.1 Aβ40ELISA

2.8.2 Aβ40/Aβ42ELISA

2.9 统计方法

讨论

参考文献

第二部分IL-17对人偏肺病毒感染中免疫细胞表达失衡的影响机制

前言

1材料

1.1 研究对象

1.2 主要试剂和溶液配制

1.3 主要仪器设备

2方法

2.1 动物模型制备

2.2 Real-time PCR检测肺部hMPV滴度

2.14 统计学方法

3 结果

4 结论

参考文献

致 谢

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摘要

第一部分 海藻糖对阿尔茨海默症中APP代谢的分子机制研究 目的: 阿尔茨海默症(Alzheimer ’s Disease; AD)是一种常见的中枢神经系统变性疾病。淀粉样蛋白前体(amyloid precursor protein;APP)的代谢异常为AD发病的可能原因。近年来研究者发现海藻糖能够调节自噬;清除异常蛋白。已有研究表明其可用于部分神经变性疾病的治疗;但目前关于海藻糖对阿尔茨海默症的治疗作用尚不清楚。本研究通过建立细胞及动物模型;初步探讨海藻糖对AD相关APP代谢的影响。 方法: 首先;将20E2和HAW细胞系分别用不同浓度的海藻糖干预24小时;使用western blotting及ELISA检测代谢过程中APP、CTF、PS1、LC3II/LC3I及Aβ的改变。其次;将20E2及HAW细胞系分为对照组;50mM海藻糖干预组;氯喹干预组及50mM海藻糖加氯喹联合干预组。在分别干预24小时后;用western blotting检测APP的改变。再次;在不同浓度海藻糖干预24小时后;用单溶液细胞增殖检测试剂盒(MTS)检测HEK细胞的细胞存活率。最后;使用海藻糖干预APP23转基因小鼠(AD模型鼠);将9个月的APP转基因小鼠随机分为对照组和实验组。实验组给予海藻糖干预1个月;对照组则给予正常饮水1个月。采用Morris水迷宫行为学实验;检测海藻糖干预后小鼠空间学习与记忆能力的变化。并使用western blotting及ELISA检测APP、CTF、PS1、LC3II/LC3I及Aβ的表达变化。使用免疫组化及Thioflavin-S染色方法检测老年斑的数量变化。 结果: 体外实验结果表明;50mM海藻糖干预组与对照组比较;20E2和HAW细胞系中APP、CTF及LC3II/LC3I的表达明显升高;而PS1蛋白表达无明显改变。同样的;100mM海藻糖干预组与对照组相比;20E2和HAW细胞系中APP及CTF表达明显增加;且与50mM海藻糖干预组相比较;100mM海藻糖干预组的APP及CTF增加更为明显。此外;在20E2细胞系中;海藻糖干预后细胞分泌的Aβ40及Aβ42较对照组有明显降低。 在20E2及HAW细胞系中;与对照组相比;50mM海藻糖干预组的APP表达明显增加;同样的;50mM海藻糖加氯喹联合干预组及氯喹干预组的APP表达均较对照组明显升高;但50mM海藻糖加氯喹联合干预组与氯喹干预组相比较;二者APP表达无明显统计学差异。此外;与对照组相比; 50mM海藻糖干预组的LC3II/LC3I明显增加。而在不同浓度的海藻糖(0.1mM;1mM; 10mM;100mM;200mM)干预24小时后;HEK细胞的细胞存活率较对照组无明显变化。 体内实验表明;海藻糖干预组的小鼠脑组织内的APP及CTF蛋白水平较对照组均明显升高;PS1及BACE1蛋白表达则无明显改变;LC3II/LC3I有明显增加;Aβ40表达下降;并且老年斑的数量明显减少。但是海藻糖干预组及对照组相比;水迷宫实验无明显统计学差异。 结论: 实验结果表明海藻糖可以在体外和体内影响APP代谢;减少老年斑的形成。但不能明显改善APP23转基因小鼠(AD模型小鼠)的学习和记忆功能。 第二部分IL-17对人偏肺病毒感染中免疫细胞表达失衡的影响机制 目的:人偏肺病毒(human Metapneumovirus ; hMPV)是2001年由荷兰学者Van den Hoogen等人首次从呼吸道感染儿童NPA标本 中分离的一种新的人类呼吸道病毒病原体;属于副粘病毒科偏肺病毒属;为单负链非节段性RNA病毒。急性hMPV感染与体内长期肺部炎症、气道阻力和气道高反应性有关。大量临床和动物研究显示Th17/IL-17在抗病毒感染免疫方面扮演重要角色;但是到目前为止;hMPV感染后Th17/IL-17参与的免疫机制目前尚未见相关报道。本研究旨在探讨IL-17在人偏肺病毒(hMPV)引起的肺部炎症中的影响机制。 方法:IL-17 KO小鼠及WT小鼠经滴鼻感染重组hMPV;于感染后5天处进行处理;肺功能检测气道高反应性;肺部灌洗获取肺泡灌洗液计数细胞分类;无菌获取肺组织用于病毒分离和病理检查;RT-PCR法检测hMPV mRNA表达;流式分析Treg细胞;Th1细胞和Th2细胞表达。 结果:IL-17 KO小鼠及WT小鼠的hMPV mRNA无明显统计学差异;肺泡灌洗液计数细胞总量及中性粒细胞数量显示;IL-17 KO小鼠感染组较WT小鼠感染组明显降低;肺功能检测(乙酰胆碱25-50mg/ml)结果表明IL-17 KO小鼠感染组较WT小鼠感染组Penh值明显降低。流式分析结果提示IL-17 KO小鼠较WT小鼠的Treg细胞升高;而Th1细胞和Th2细胞下降;在感染hMPV后该现象则更为明显。 结论: IL-17KO小鼠呈现出Treg细胞偏移现象;在感染人偏肺病毒后Treg细胞持续升高;而Th1细胞和Th2细胞则明显下降;从而主导抗炎效应。

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