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高浓度紫杉醇诱导胞质空泡化样细胞死亡的分子机制研究

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文摘

英文文摘

第一章 绪论

1.1 细胞死亡方式概述

1.2 细胞紫杉醇诱导不同细胞死亡方式的研究现状

1.3 激光共聚焦显微镜的原理及应用

1.3.1 激光共聚焦显微镜的原理及特性

1.3.2 激光共聚焦显微镜系统在生物医学中的应用

1.4 FRET原理及应用

1.4.1 FERT基本原理

1.4.2 FERT应用

1.5 本研究的目的和意义

第二章 高浓度紫杉醇诱导细胞副凋亡

2.1 引言

2.2 实验仪器和材料

2.2.1 主要仪器

2.2.2 主要试剂

2.2.3 细胞系

2.2.4 质粒

2.3 实验方法

2.3.1 细胞培养

2.3.2 细胞转染

2.3.3 染色技术

2.3.4 细胞活性检测

2.3.5 荧光光谱检测技术

2.3.6 流式细胞仪检测

2.3.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western Blot检测

2.3.8 衰老相关—3—半乳糖苷酶活性检测

2.3.9 激光扫描共聚焦显微镜成像技术

2.3.10 数据分析

2.4 实验结果

2.4.1 高浓度紫杉醇诱导的细胞死亡特征不同于凋亡和有丝分裂灾变

2.4.2 紫杉醇诱导的细胞细胞死亡过程中细胞膜完整性检测

2.4.3 检测高浓度紫杉醇诱导细胞死亡过程中衰老相关β半乳糖苷酶的活化情况

2.4.4 紫杉醇诱导的细胞细胞死亡符合副凋亡的特征

2.5 本章总结与讨论

第三章 高浓度紫杉醇诱导副凋亡的分子机制研究

3.1 引言

3.2 实验仪器和材料

3.2.1 主要实验仪器

3.2.2 主要试剂

3.2.3 细胞系和质粒

3.3 实验方法

3.3.1 细胞培养和细胞转染

3.3.2 细胞活性检测

3.3.3 激光扫描共聚焦显微镜成像技术

3.3.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳和western—blotting检测

3.3.5 数据分析

3.4 实验结果

3.4.1 蛋白质合成在高浓度紫杉醇诱导的副凋亡中的作用研究

3.4.2 MAPK途径在高浓度紫杉醇诱导的副凋亡中的作用研究

3.4.3 ROS在高浓度紫杉醇诱导的细胞质空泡化中的作用研究

3.4.4 Bcl—xl在紫杉醇诱导的空泡化中的作用研究

3.5 本章总结与讨论

第四章 高浓度紫杉醇诱导肿瘤细胞质空泡化的在体治疗研究

4.1 引言

4.2 实验仪器和材料

4.2.1 主要实验仪器

4.2.2 主要试剂和材料

4.2.3 细胞系和小鼠

4.3 实验方法

4.3.1 小鼠皮下肿瘤种植、瘤内注射紫杉醇和肿瘤组织电镜分析

4.4 实验结果

4.4.1 瘤内注射紫杉醇诱导了细胞质空泡化

4.5 本章总结与讨论

第五章 总结与展望

5.1 本文研究的主要内容与结论

5.2 本文的主要创新之处

5.3 展望

参考文献

作者在读硕士生期间发表的学术论文

致谢

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摘要

细胞死亡方式有多种类型,包括坏死、凋亡、自噬、有丝分裂灾变、胀亡、衰老样的细胞死亡和副凋亡等。高浓度紫杉醇诱导的胞质空泡化样细胞死亡是我们小组最近观察到的一种新的细胞死亡现象,该将其归类于哪种细胞死亡方式尚无定论,其分子机制几乎完全未知。本论文对高浓度紫杉醇诱导的胞质空泡化样细胞死亡现象的形态指标、生化指标等特征进行了研究,基于这些特征探讨了这一死亡现象的分类归属;然后研究了这种死亡方式的分子机制;最后初步探讨了利用紫杉醇诱导空泡化的机制在体肿瘤治疗的可能性。本研究加深了人们对这种细胞死亡方式的认识,同时也为将紫杉醇诱导空泡化的机制用于临床提供理论指导。
   本文第一章绪论部分概述了不同细胞死亡方式的主要特征和紫杉醇诱导不同细胞死亡方式的研究现状,同时说明了本论文的研究目的和意义。
   本论文实验部分主要分为三部分:
   第一部分:利用共聚焦显微镜、流式细胞仪和Western Blot等技术研究了高浓度紫杉醇诱导胞质空泡化样细胞死亡的特征,结果如下:1)高浓度紫杉醇诱导的胞质空泡化样细胞死亡的没有细胞皱缩反而肿胀,没有凋亡小体形成,没有细胞核断裂,磷脂酰丝氨酸不外翻,对caspase广谱抑制剂不敏感,caspase 3不活化等,这些实验结果都表明高浓度紫杉醇诱导的细胞死亡现象不是凋亡;2)高浓度紫杉醇诱导的细胞死亡中细胞核没有多个微小细胞核的形成也不符合有丝分裂灾变的特征;3)PI染色显阴性,说明细胞膜完整性没有破坏,不符合坏死和胀亡的特征;4)衰老相关β半乳糖苷酶活性检测显阴性,不符合衰老性细胞死亡的特征;5)然而却符合副凋亡的这些主要特征:衍生于内质网的细胞质空泡化、线粒体肿胀、没有凋亡小体、没有核断裂、caspase不活化、不被caspase的抑制剂抑制等。所以我们认为高浓度紫杉醇诱导的胞质空泡化样细胞死亡现象应归属于副凋亡。
   第二部分:利用共聚焦显微镜和Western Blot等技术研究了高浓度紫杉醇诱导副凋亡的分子机制:1)利用蛋白质合成抑制剂放线菌酮(CHX)研究确定了高浓度紫杉醇诱导的细胞副凋亡不需要蛋白质合成的参与;2)MAPK途径包括三各成员MEK、JNK、P38,分别利用MEK、JNK、P38的专一性抑制剂,研究了这三条途径在高浓度紫杉醇诱导的细胞死亡和细胞质空泡化中的作用,并通过Western Blot研究了ERK、JNK和P38的活化情况。最后证明高浓度紫杉醇诱导的细胞副凋亡不需要MAPK途径参与;3)利用总的活性氧(ROS)的清除剂研究了ROS在高浓度紫杉醇诱导胞质空泡化中的作用,表明高浓度紫杉醇不是通过ROS诱导空泡化产生的;4)共转Bcl-xl-YFP和er-RFP共聚焦显微镜动态实时观察Bcl-xl和内质网的相对空间位置变化,表明Bcl-xl围绕在肿胀的内质网周围。但是Bcl-xl的抑制剂HA14-1却没有抑制高浓度紫杉醇诱导的空泡化,Bcl-xl在高浓度紫杉醇诱导的空泡化中的作用还有待进一步研究。
   第三部分:在Balb/c小鼠皮下种植肿瘤,然后通过在体瘤内注射紫杉醇的方式利用电镜技术研究确定了紫杉醇在体内同样可以诱导内质网和线粒体空泡化,初步展示了通过紫杉醇诱导的空泡化机制进行肿瘤治疗的前景。

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