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多替泊芬、Photosoft和5-氨基酮戊酸对小鼠S180肿瘤的光动力作用研究

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摘要

前言

材料与方法

一、材料

二、实验方法

结果

一、成功建立皮下实体瘤小鼠模型

二、肿瘤大体形态的变化

三、肿瘤体积变化及抑瘤率

四、肿瘤细胞凋亡、坏死比例

五、肿瘤病理组织学变化

六、各组肿瘤组织的血管数

讨论

结论

参考文献

附录 英文缩略词表

攻读学位期间发表论文及参编专著

致谢

声明

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摘要

研究背景
　　 癌症已经成为人类的首要死因。据世界卫生组织(WHO)报道，2008年全球有760万人死于癌症，每年新发癌症病例接近1300万，接近三分之二的死亡病例和新发病例发生在发展中国家。癌症将是我们必须面对的多发病和常见病，因此，加强对癌症预防和治疗的研究成为我们迫切的需求。
　　 光动力疗法(Photodynamic Therapy，PDT)是一种非常有前途的肿瘤治疗方法，它是利用光化学反应原理，通过特定波长的光激活肿瘤组织内滞留的光敏剂，使其与肿瘤组织内的氧发生作用，产生化学性质活泼的单态氧(1O2)及其他一些活性氧物质(radical oxygen species，ROS)，并通过氧化作用攻击细胞结构，导致蛋白质、核酸和脂类等生物大分子发生氧化损伤，当氧化损伤的积累超过一定的阈值时导致细胞死亡，从而起到治疗作用。PDT包括两个步骤:首先全身或局部给予光敏剂，一段时间后光敏剂选择性滞留于肿瘤组织中;然后用波长与光敏剂吸收光谱相符的光照射肿瘤局部，滞留在肿瘤组织内的光敏剂吸收光后使分子氧转化为以单态氧为主的ROS，ROS可以通过多种途径破坏肿瘤组织。由此可知PDT具有两次选择性，第一是光敏剂在肿瘤组织的选择性积聚，第二是光照波长、强度和部位的选择，使PDT具有相对特异性杀伤肿瘤组织，对正常组织损害小的优点。
　　 光动力疗法是一种药械联用的肿瘤微创治疗方法，在局部或全身给予光敏剂后，使用光导纤维介导激光在体表进行照射，或配合内镜在内腔器官如气管、食管、鼻咽部、胆总管和膀胱等进行腔内照射，也可以在较大的肿瘤组织中行多点穿刺插入光纤进行组织间照射。而对于通过手术方法暴露的肿瘤，如骨肿瘤、脑肿瘤等，也可联合PDT行表面照射或在影像设备辅助下行组织间照射。对于早期、原位的恶性肿瘤可以达到根治的效果，对于中晚期肿瘤则可作姑息治疗，改善患者生存质量，延长生存期。与常规的手术、放疗、化疗等疗法相比，光动力疗法具有创伤小，毒性小，选择性、适用性、重复性好，可姑息治疗，可消灭隐性病灶，可保护容貌及重要器官等优点，目前已在世界多个国家获得批准应用，其适应症包括皮肤癌、食管癌、胃癌、肺癌、头颈部肿瘤、膀胱癌、妇科肿瘤、鼻咽癌、胆管癌以及癌前病变等，还可以用于眼科等多种非肿瘤疾病的治疗。
　　 光动力疗法杀伤肿瘤的作用机制包括:(1)细胞毒性作用，直接杀伤肿瘤细胞，使肿瘤细胞坏死或凋亡;(2)血管毒性作用，损伤血管内皮细胞，引起出血、血栓形成，从而引起肿瘤组织缺乏氧和营养物质供应，继而进一步引起肿瘤细胞死亡;(3)在局部诱发的非特异性炎性反应以及后期的一系列免疫反应也有抑制和破坏肿瘤的作用。充分阐明PDT的反应原理和抗肿瘤机制，是使PDT更好地应用于临床的基础前提。
　　 光源、分子氧和光敏剂是PDT的三大要素，其中光敏剂是核心。PDT临床应用亟待解决的问题是新型光敏剂的开发。理想的光敏剂应该具备以下特点:(1)在可见光的红区(＞650nm)有强吸收;(2)单态氧和三重态量子产率高;(3)低暗毒性;(4)在癌组织上可被选择性吸收，对健康组织，特别是皮肤应不吸收或少吸收;(5)容易大量合成，容易保存;(6)根据药物动力学的要求，多余的药物应能很快从体内排泄。
　　 探索安全有效的光敏剂是光动力疗法更好应用于临床的关键。Photofrin等进口光敏剂价格昂贵，阻碍了光动力疗法在国内的普及应用。探索研究疗效确切，副作用少，价格便宜，有自主产权的光敏剂，有利于光动力疗法在中国更广泛地开展。
　　 研究目的：
　　 本研究通过观察多替泊芬、Photosoft和5-氨基酮戊酸(ALA)这三种光敏剂对小鼠纤维肉瘤的光动力治疗疗效，并初步探讨它们抗肿瘤机制，为临床应用提供实验依据。
　　 研究内容和方法：
　　 1.皮下实体瘤小鼠模型的建立:复苏、体外培养S180小鼠纤维肉瘤细胞，首先于小鼠腹腔种植S180肿瘤细胞，建立腹水瘤小鼠模型。取腹腔种植肿瘤细胞7-10天的腹水型荷瘤小鼠，抽取腹水，收集S180肿瘤细胞，稀释调整成细胞浓度为1×107/ml的细胞悬液，抽取0.2ml（即2×106个）混匀的细胞悬液分别于小鼠双侧臀部皮下注射，建立皮下实体瘤小鼠模型。观察小鼠皮下肿瘤的生长，约5-7天后肿瘤直径长至5-7mm，即开始行光动力治疗。
　　 2.分组与治疗:取肿瘤生长良好的昆明小鼠40只随机分为以下4组:(1)多替泊芬10mg/kg组;(2) Photosoft20mg/kg组;(3) ALA100mg/kg组;(4)空白对照组。(1)、(2)组小鼠尾静脉注射光敏剂8-10h后行激光照射，第(3)组尾静脉注射光敏剂3h后行激光照射;(1)、(3)组使用波长为630nm激光照射（广西桂林兴达光动力治疗仪），第(2)组使用660～795nm激光照射(THECHO GROUP双频光动力治疗仪)。照光前，用1％戊巴比妥钠以60mg/kg腹腔注射麻醉小鼠，激光垂直照射肿瘤局部，光斑直径1.2-1.5cm，保证光斑覆盖整个肿瘤，并覆盖肿瘤四周边缘约3-5mm的正常组织，功率密度150mW/cm2，能量密度180J/cm2，照光时间各20min。第(4)组不做任何处理。
　　 3.肿瘤大体形态及体积变化的观察:治疗前及治疗后每隔3天观察肿瘤外观的变化，拍照记录，并用游标卡尺量度肿瘤长径(a)与短径(b)，计算肿瘤体积(=ab2×1/2)，绘制肿瘤生长曲线，以治疗后第21天为观察终点，计算抑瘤率（=（对照组平均体积-治疗组平均体积）/对照组平均体积×100％)。
　　 4.抗肿瘤机制的初步探讨:各组治疗后24h处死5只小鼠，取一侧皮下肿瘤，用眼科剪剪碎，200目细胞筛过滤，制成细胞悬液，按照FITC Annexin V/PI双染色凋亡检测试剂盒说明书进行操作，上流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡、坏死情况。取另一侧皮下肿瘤，常规福尔马林固定，脱水，浸蜡，包埋，切片，HE染色，光学显微镜下观察肿瘤组织病理学变化，并用CD31抗体行免疫组化染色，观察计算肿瘤组织血管数。
　　 5.统计学处理:采用SPSS13.0软件进行统计分析，所用数据以均数±标准差（mean±SD）表示。采用方差分析，多个样本均数间比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
　　 研究结果：
　　 1.肿瘤大体形态的变化
　　 空白对照组的小鼠的肿瘤逐渐增大，生长速度较快。各治疗组肿瘤大体形态观察结果显示，PDT治疗后ALA组皮损最轻，皮肤修复最快，其次是Photosoft组，皮损较重的是多替泊芬组，部分小鼠直至第21天焦痂未完全褪去。但ALA组抑瘤效果不理想，大多数的皮下肿瘤继续增长，而多替泊芬与Photosoft组抑瘤效果较好，大多数的皮下肿瘤消失，小部分残留继续生长。
　　 2.肿瘤体积变化及抑瘤率
　　 治疗前各组肿瘤体积均数间无统计学差异(P＞0.05)。治疗后第21天，各治疗组与空白对照组间有统计学差异(P＜0.05)，治疗组间Photosoft组与ALA组有统计学差异(P=0.048)。各治疗组与空白对照组相比都能抑制肿瘤的生长，其中Photosoft组比ALA组取得更好的疗效，而与多替泊芬组效果相当。Photosoft组的抑瘤率为75.35％，多替泊芬组的抑瘤率为62.48％，ALA组的抑瘤率为37.17％。
　　 3.肿瘤细胞凋亡、坏死的比例
　　 从检测结果的平均值分析，各治疗组的凋亡及坏死的细胞（包括早期凋亡、晚期凋亡和坏死细胞）所占比例与空白对照组有统计学差异(P＜0.01)，其中各治疗组早期凋亡细胞所占比例与空白对照组有统计学差异(P＜0.01)。各治疗组的凋亡及坏死的细胞所占比例比空白对照组明显增多，而正常活细胞明显减少，说明各治疗组杀伤肿瘤细胞效果明显。
　　 4.肿瘤病理组织学变化
　　 光镜下观察，空白对照组的肿瘤组织中央部位有小范围的坏死，边缘瘤组织细胞增殖旺盛，外被有包膜;肿瘤细胞大而核深染，核浆比例大，核异型性明显，可见核分裂。各治疗组所得结果相似，从外到内可见肿瘤包膜，肿瘤细胞存活带，肿瘤细胞坏死带，失去细胞结构的均质红染区。各治疗组可见肿瘤血管内红细胞淤积，部分血管破裂，红细胞外溢，部分血管血栓形成;并可见部分坏死灶周围有大量中性粒细胞浸润。
　　 5.各组肿瘤组织的血管数
　　 各组肿瘤组织在高倍视野(×400)下的血管平均数的统计分析结果示，多替泊芬组与空白对照组有统计学差异(P=0.000)，Photosoft组与空白对照组有统计学差异(P=0.005)，ALA组与空白对照组无统计学差异(P=0.718)。统计结果表明，在PDT治疗24h后，多替泊芬组和Photosoft组能引起肿瘤血管数明显下降，而ALA组对肿瘤血管数无明显影响。
　　 研究结论：
　　 本研究验证了使用多替泊芬、Photosoft、ALA这三种光敏剂进行光动力治疗都能抑制小鼠S180肿瘤的生长，其中Photosot组比ALA组的效果好，与多替泊芬组效果相当。治疗后早期各治疗组杀伤肿瘤细胞的效果都非常明显，多替泊芬组和Photosoft组对肿瘤血管损伤明显，而ALA组血管损伤不明显。各治疗组均有部分小鼠未获得治愈，需要继续深入研究以达到更好的抗肿瘤效果。

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