克雷伯氏菌甘油脱水酶和1，3-丙二醇氧化还原酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

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第一章前言

1.1克雷伯氏菌

1.2大肠杆菌表达系统

1.3技术路线

第二章材料与方法

2.1实验材料

2.1.1菌株与质粒

2.1.2酶与试剂

2.1.3主要仪器设备

2.1.4常用缓冲液配方

2.2方法与步骤

2.2.1 Klebsiella pneumoniae的复苏培养

2.2.2菌种的保存

2.2.3 Klebsiella pneumoniae基因组总DNA的制备

2.2.4甘油脱水酶基因(dhaB)和1，3-丙二醇氧化还原酶基因(dhaT)的引物设计和PCR扩增

2.2.5大肠杆菌感受态的制备

2.2.6质粒DNA的大量制备

2.2.7少量提取质粒

2.2.8 DNA的酶切与连接

2.2.9连接产物对大肠杆菌感受态细胞的转化

2.2.10阳性克隆的筛选和酶切验证

2.2.11重组子的质粒PCR验证

2.2.12含RBS序列的dhaT基因扩增

2.2.13菌液PCR

2.2.14重组菌株的诱导表达

2.2.15大肠杆菌细胞的破碎

2.2.16甘油脱水酶活力的测定

2.2.17外源基因在大肠杆菌中的表达检测

2.2.18蛋白质的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.2.19重组大肠杆菌利用甘油的摇瓶发酵实验

第三章结果和分析

3.1甘油脱水酶基因(DHAB基因)表达质粒的构建

3.1.1 dhaB基因的克隆

3.1.2 pGEM-3zf+重组克隆质粒的验证

3.1.3甘油脱水酶基因(dhaB)基因的序列分析

3.1.4甘油脱水酶基因(dhaB)与pSE380载体的连接

3.1.5甘油脱水酶活性的测定及SDS-PAGE检测

3.2 1，3-丙二醇氧化还原酶基因(DHAT)表达质粒的构建

3.2.1 dhaT基因的克隆

3.2.2 pGEM-3zf+重组克隆质粒的验证

3.2.3 dhaT基因的序列分析

3.2.4 1，3-丙二醇氧化还原酶基因(dhaT)与pSE380载体的连接

3.2.5表达产物的SDS-PAGE分析

3.3多顺反子表达质粒的构建

3.3.1多顺反子表达质粒的构建

3.3.2含RBS序列的dhaT基因扩增

3.3.2多顺反子表达质粒的构建

3.3.3 PCR确定目的片段的插入方向

3.3.4表达产物的SDS-PAGE分析

3.4重组菌株甘油发酵实验

第四章讨论

4.1甘油脱水酶基因的扩增

4.2 SD序列与ATG之间的距离

4.3 DNA的体外重组

4.4外源基因在大肠杆菌中的表达

4.5问题与展望

第五章结论

参考文献

致谢