浓香型白酒窖泥梭菌群落多样性及高产丁酸梭菌发酵特性研究

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A Dissertation Submitted to

of Engineering Science

School of Food and Bio-Engineering

摘要

As one of the four basic flavor liquor in China,

第一章 绪论

1.1浓香型白酒窖泥

1.1.1浓香型白酒概述

浓香型白酒又称泸型白酒，其典型代表为泸州老窖特曲，且己酸乙酯被确认为该香型白酒的主体香气物质。从其风

窖泥是浓香型白酒生产的必备材料，为酿酒和生香微生物提供足够的营养物质和良好的生长环境，被认为是形成己

1.1.3窖泥微生物群落多样性的研究方法

1.1.4窖泥中梭菌的研究现状

1.1.5梭菌群落结构与白酒风味化合物之间的关系

1.2丁酸的概述

1.2.1丁酸的结构

1.2.2丁酸的性质及用途

1.3微生物发酵法生产丁酸的研究

1.3.1 产丁酸微生物

1.3.2丁酸的产生途径

图1-2梭菌的丁酸产生途径

1.3.3 微生物发酵生产丁酸的工艺研究及研究进展

目前，丁酸的工业生产主要依靠化学合成法。化学合成法分为丁醛氧化法[79]和丙烯羰基合成法[80]两种

1.3.3.1丁酸的摇瓶优化研究

1.3.3.2丁酸的发酵工艺研究

1.4选题的目的及意义

1.5主要研究内容

1.6技术路线

第二章 浓香型白酒窖泥中免培养与可培养梭菌群落结构分析

2.1实验材料

2.1.1样品采集

2.2.2主要试剂

2.2.3主要仪器

2.2实验方法

称取放置于4℃的窖泥样品10 g，加入装有100 mL无菌水及10 粒已灭菌玻璃珠（φ = 3 mm

2.2.3纯化菌株的发酵培养

依次挑取RCM和ES培养基中分离获得的单菌落并命名，分别接种于含有10 mL 相应液体培养基的试管中

2.2.4 窖泥及纯化菌株基因组DNA的提取

2.2.4.1窖泥基因组DNA的提取

参照FastDNA? SPIN Kit for Soil (MP Biomedical,Clevel

2.2.4.2 纯化菌株基因组DNA的提取

分别吸取厌氧培养48 h的纯化菌株发酵液1 mL置于无菌EP管中，10,000 r/min离心1 m

2.2.5 PCR扩增及测序

以提取的窖泥基因组DNA为模板进行PCR扩增，引物为梭菌特异性引物SJ-F（12个碱基的barcod

PCR扩增产物的纯化、高通量测序接头的连接、DNA文库的构建及Illumina Miseq测序分析及

2.2.5.2纯化菌株基因组DNA的PCR扩增及测序

2.2.6 高通量测序数据分析

2.2.6.1操作分类单元(OTU)分析

2.2.6.2稀疏曲线分析

2.2.6.3分类学分析

2.2.7菌株分子鉴定及系统发育树的构建

将测得的每株可培养梭菌单菌株16S rRNA基因序列及高通量测序中相对含量>1%的序列在NCBI数据

2.3.1梭菌群落多样性分析

2.3.1.1 梭菌群落的OTU分类及测序数据合理性分析

2.3.1.2 窖泥中梭菌群落结构组成

2.3.1.3 窖泥主要梭菌的系统发育分析

2.3.2.1分离菌株16S rRNA基因的系统发育分析

2.4本章小结

第三章 顶空固相微萃取-气质联用法分析窖泥中可培养Clostridium spp.挥发性代谢物成分

3.1材料

3.1.1 试验材料

选取窖泥中筛选出的8个系统发育簇中生长性能优良的代表性菌株：RL1（C. tyrobutyricum

3.1.2主要试剂

薄荷醇（色谱纯，纯度>98%），美国Sigma公司；其余试剂见2.2.2。

3.1.3主要仪器

3.2方法

3.2.1培养基的配制

3.2.3可培养Clostridium spp.发酵液的气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析

3.3 结果与讨论

3.3.1菌株Clostridium spp.挥发性代谢物检测

在酿造过程中，醇类化合物主要由微生物利用糖、果胶、氨基酸等物质代谢产生，多具有甜味、花香及青草香味等

脂肪酸是所有白酒中含量较高且重要的一类化合物，其在白酒中的总量、种类及组成影响白酒的香型及品质。脂肪

酯类是浓香型白酒最重要的一类呈香化合物，且大部分的酯类化合物由于沸点比较低，经过蒸馏很容易进入基酒中

3.3.2主成分分析

根据表3-2中的结果可知，8株Clostridium spp.所产挥发性代谢物种类及产量存在明显差异

3.4 本章小结

第四章 高产丁酸菌株发酵性能的优化

4.1 材料

4.1.1实验材料

4.1.2主要试剂

4.1.3主要仪器

4.2 实验方法

4.2.1培养基的制备

4.2.2种子的活化及菌株培养方法

4.2.3高产丁酸梭菌菌株的确定

4.2.4菌体浓度测定

4.2.5发酵液中丁酸浓度的定量分析

4.2.5.1发酵液前处理

4.2.5.2标准品的配制

4.2.5.3色谱条件

4.2.6生长曲线的绘制及产生丁酸的测定

4.2.7高产丁酸梭菌培养条件优化

4.2.7.1单因素优化试验

4.2.8高产丁酸梭菌培养基组成的优化

4.2.8.1Plackett-Burman设计

4.2.8.2最陡爬坡试验

4.2.8.3 Box-Behnken设计

4.3结果与分析

4.3.1标准曲线的绘制

4.3.2 高产丁酸菌株的确定

4.3.3 RL1生长曲线的绘制及丁酸的检测

4.3.4 RL1培养条件优化

4.3.4.1单因素试验结果

4.3.4.2正交试验

4.3.5 RL1培养基优化结果

4.3.5.1 Plackett-Burman试验筛选显著影响因素

4.3.5.2最陡爬坡实验设计及结果

4.3.5.3 Box-Behnken设计筛选显著因素的最佳浓度

4.4本章小结

第五章 结论与展望

5.1结论

(2)采用HS-SPME-GC-MS技术对8个系统发育簇中的代表性梭菌菌株发酵液进行提取和检测，共检

5.2展望

致谢

参考文献

附录 攻读硕士学位期间发表论文目录