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MiR-203a在人食管鳞癌中的表达及柠檬苦素化合物抑制食管癌细胞增殖的机制研究

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食管癌(Esophagus cancer EC)是全球癌症相关死亡的主要原因之一;尤其在中国等亚洲国家非常流行。尽管随着诊断技术的革新和手术的进步以及分子靶向、免疫等治疗的应用大大提升了患者的生存期。但大量的食管癌患者发现时已是晚期;且预后较差;目前仍然主要依靠放射/化学疗法以及食道切除术等手术方案进行治疗。因此;更为深入地理解食管癌的发病机理及分子机制;并寻找疗效确切;副作用小的天然药物;依然是全世界专家学者亟待解决的问题。 本研究在基因水平上探讨了miR-203a的表达与食管鳞癌发生、发展的关系。并且研究了 9 种柠檬苦素类化合物;检测了它们抑制食管肿瘤细胞的增殖活性;筛选出具有明显抑制食管肿瘤细胞增殖活性的四种化合物;并对Xylogranatin C化合物抑制食管肿瘤增殖活性的作用机制进行了初步探讨;以及探讨了Xylogranatin C对食管癌细胞中miR-203a基因表达水平的影响;这对于高效低毒的抗肿瘤药物研发以及新的抗癌先导化合物的基础研究都具有非常重要的意义。 第一部分 miR-203a在人食管鳞癌中的表达及意义 目的：食管癌组织学分型包括鳞状细胞癌;腺癌;未分化癌等五种类型;以鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma; ESCC)最常见。目前食管癌的发病机制尚不明确;本研究通过检测miR-203a基因在食管鳞癌组织及正常癌旁组织中的表达;探讨miR-203a基因的表达与食管鳞癌发生、发展的关系;从而为食管鳞癌发生的分子机制、评估预后等方面提供新的理论依据。 方法： 1. 应用实时定量RT-PCR（Quantitative real-time RT-PCR;qRT-PCR）方法检测 119 例食管鳞癌组织及其相应的癌旁组织中miR-203a基因的表达。 2. 采用Kaplan Meier方法分析miR-203a的表达状态与食管鳞癌预后的关系。 结果： 1. miR-203a在食管鳞状细胞癌组织及其正常的癌旁组织中可被检测到。miR-203a基因的表达在癌组织中的表达水平明显低于正常的癌旁组织。miR-203a的表达特点与TNM分期、分化程度;淋巴结转移、远处转移或复发;以及UGIC家族史相关。 2. miR-203a基因表达减低的食管癌患者显示较低的5年生存率。TNM分期、miR-203a的表达是与ESCC患者的生存独立相关。 结论： 1. miR-203a基因在食管鳞癌组织及正常的癌旁组织均表达;但是在癌组织中的表达明显低于其相应的癌旁组织;提示 miR-203a基因在食管鳞癌中可能主要起抑癌基因的作用。 2. miR-203a的表达与TNM分期、病理分化;淋巴结转移、远处转移或复发;以及UGIC家族史相关; 3. TNM分期、miR-203a的表达是ESCC患者独立预后因素。 第二部分 柠檬苦素类化合物抑制食管癌细胞增殖活性筛选 目的：柠檬苦素类化合物是一类高度氧化的四降三萜化合物;在上世纪七八十年代;该类化合物受到专家学者的广泛关注;并进行了初步研究;结果显示;其不仅具有如杀虫、抑菌、抗病毒等多种生物活性;同时;抗肿瘤的作用与疗效最为引人注目。本研究采用 9 种已分离提纯的柠檬苦素类化合物为研究对象;对食管癌细胞的抑制活性进行了筛选;其目的是筛选出抑制效果最强的化合物。 方法：应用MTT比色法进行细胞增殖活性筛选检测柠檬素苦素类化合物对食管癌细胞(Eca109 细胞和EC9706 细胞)增殖的抑制作用;以期筛选出具有抗肿瘤作用的单体化合物;并计算药物的半数抑制浓度(IC50值)。 结果：顺铂（100μmol/L）与食管癌细胞(Eca109和EC9706)共培养后;均显示了较强的增殖抑制活性；化合物spicatin (3)、7-deacetyl-7-oxogedunin (4)、xylogranatin C (5)和xylocarponoid A (7) 对Eca109细胞增殖显示较强的抑制活性;细胞生存率分别为9.19%、5.01%、4.04%和7.15%；这四种柠檬苦素类化合物处理EC9706肿瘤细胞生存率分别为21.93%、19.78%、8.25%和12.33%。通过肿瘤细胞增殖生存率对化合物3、4、5、7浓度的对数回归方程;得到四种化合物对Eca109 和EC9706 细胞增殖的IC50。 化合物2为甾体;化合物1和3为原柠檬苦素;化合物4为D环开裂柠檬苦素;化合物5、6、7、8、9为B、D环开裂柠檬苦素。化合物5和6虽然名称是相同的;但来源于不同的文献;并且结构不同。化合物3、4、5、7因A环均含有α、β-不饱和酮结构片段而显示出对食管癌Eca109、EC9706细胞有较强的增殖抑制活性。 结论：柠檬苦素类化合物spicatin (3)、7-deacetyl-7-oxogedunin (4)、xylogranatin C (5)和xylocarponoid A (7)对食管癌细胞的增殖具有明显的抑制作用；柠檬苦素类化合物的特有的骨架结构以及α;β-不饱和酮是抗食管癌细胞增殖的必须结构。 第三部分 Xylogranatin C抑制人食管癌细胞增殖作用机制研究 目的：大量研究报道发现传统中草药制剂中的很多生物活性成分具有明显的抗肿瘤疗效。尽管作用机制复杂;但许多的成分是通过诱导肿瘤细胞凋亡作用来实现其生物活性。而对于基因方面的影响目前未见相关报道。第一部分的实验发现miR-203a基因在食管鳞癌组织低表达时患者预后差;第二部分的实验从木果楝中筛选出四种对人食管肿瘤细胞增殖有明显抑制作用的化合物。本部分实验将以xylogranatin C为代表对这类化合物的作用机制进行初步研究;以明确这类化合物是否通过诱导肿瘤细胞凋亡以及是否上调miR-203a基因而发挥其生物活性。 方法：采用流式细胞分析技术检测 10 μmol/L 和 20 μmol/L 的Xylogranatin C作用Eca109后;是否能诱导肿瘤细胞的凋亡作用；Western Blot检测柠檬苦素化合物xylogranatin C作用Eca109细胞后P53、Bax、Caspase-3和GRP78蛋白表达的变化；qRT-PCR方法检测xylogranatin C作用Eca109细胞后;miR-203a表达情况。 结果:流式细胞技术检测Eca109细胞的凋亡;其实验结果显示：10μmol/L和20μmol/L的Xylogranatin C处理Eca109细胞12 h和 24 h后;Eca109细胞凋亡率分别为(8.63 ± 0.91)%、(25.76 ± 1.44)%和(11.13 ± 1.80)%、(46.17 ± 1.56)%;与空白对照组相比较;差异具有显著性 (P<0.01; P<0.05);说明化合物Xylogranatin C促进了Eca109 细胞的凋亡。 xylogranatin C对Eca109 细胞内与细胞凋亡相关的p53蛋白、Bax蛋白、Caspase-3 和 GRP78 蛋白的上调作用：10umol/L 和 20umol/L 的xylogranatin C处理Eca109细胞12h 后;Eca109细胞内的与凋亡通路相关的p53蛋白、Bax蛋白和Caspase-3的表达均上调；10umol/L和20 umol/L的Xylogranatin C处理Eca109细胞12、24h 后;Eca109细胞内的GRP78的表达上调。 qRT-PCR方法检测xylogranatin C作用Eca109细胞后;miR-203a表达情况。其实验结果显示：10μmol/L和20μmol/L的Xylogranatin C处理Eca109细胞12 h和 24 h后;miR-203a表达水平上升;并且与对照组相比有统计学意义(P＜0.01);并且随着浓度的增加、时间的延长;表达明显上升;并且12小时和24小时组相比也有统计学意义(P＜0.05)。 结论： 1. 柠檬苦素类化合物Xylogranatin C对食管癌细胞有显著的诱导凋亡的活性；Xylogranatin C诱导食管癌细胞凋亡是通过上调Eca109 细胞P53蛋白;激活Bax蛋白;最终通过Caspase-3 的级联作用诱导肿瘤细胞凋亡通路和内质网应激通路的上调CRP78 表达的多途径共同作用来实现的； 2. Xylogranatin C通过上调食管癌Eca109细胞的miR-203a表达;实现其抗肿瘤细胞的增殖作用。 总结论： 1. mirR-203a低表达参与食管鳞癌的发生和进展;且与患者预后密切相关； 2. Xylogranatin C 对食管癌细胞有显著的诱导凋亡的活性；Xylogranatin C通过上调食管癌Eca109细胞的miR-203a表达;实现其抗肿瘤细胞的增殖作用。

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