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肠杆菌科细菌及非发酵菌中整合子的研究

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前言

材料与方法

第—部分肠杆菌科细菌中整合子的研究

第二部分铜绿假单胞菌中整合子的研究

第三部分鲍曼不动杆菌中整合子的研究

参考文献

附录一

附录二

致谢

论文独创性声明及论文使用授权声明

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摘要

背景：抗菌药的大量及不合理使用促进了细菌耐药的迅速发展。目前，细菌耐药已逐渐成为一个全球性的问题，其严重后果是影响抗菌药的临床治疗效果，增加患者治疗成本，缩短新药应用周期，直接威胁人体健康。传统观念认为，细菌耐药是由基因突变引起。然而，这种基因突变引起的细菌耐药性并不能传播。近年来，整合子作为一种新的可移动的基因捕获和表达的元件被提出，整合子由5’保守区、3’保守区和两者之间的可变区组成。在整合酶的作用下，整合子可捕获外源耐药基因，在位于整合子上游的启动子作用下表达，使携带整合子的菌株具有耐药及多重耐药性，并可将自身可变区的基因切除成为游离的环状分子，介导细菌耐药性的传播。整合子是细菌，尤其是革兰阴性菌耐药性迅速发展的重要原因。但目前关于整合子的流行现状、基因盒的特性及功能尚未见大样本的地区性研究报道。 目的：本研究旨在调查南京地区肠杆菌科细菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌中整合子的种类及分布，分析整合子与这些菌耐药和多重耐药的关系，并进一步探讨整合子参与这些菌耐药和多重耐药的分子机制。 材料与方法：1.收集南京地区临床分离的肠杆菌科细菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌，采用纸片扩散法测定其药物敏感性，传统酚-氯仿法提取细菌总DNA； 2.采用整合酶基因PCR法检测整合子，对阳性扩增产物采用RFLP分析进行整合子分类； 3.按整合子检测结果，将肠杆菌科细菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌分为整合子阳性组和整合子阴性组，统计学分析整合子与这些细菌耐药和多重耐药的关联性； 4.采用整合子PCR法扩增整合子可变区，联合RFLP和DNA测序技术进行可变区分析。 结果：1.南京地区肠杆菌科细菌中整合子的检出率为63.4﹪(90/142)，其中，Ⅰ类整合子的检出率为58.5﹪(83/142)，Ⅱ类整合子的检出率为14.1﹪(20/142)，主要存在于志贺菌中，未检出Ⅲ类整合子；南京地区铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌中Ⅰ类整合子的检出率分别为40.8﹪(40/98)和52.8﹪(56/106)，均未检出Ⅱ类和Ⅲ类整合子。 2.将肠杆菌科细菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌分为Ⅰ类整合子阳性组和阴性组，统计学分析两组菌对氨基糖苷类、β-内酰胺类和喹诺酮类等临床常用抗生素药物敏感性，P值小于0.05；将志贺菌分为Ⅱ类整合子阳性组和阴性组，统计学分析两组菌对链霉素、复方新诺明、氯霉素和四环素的药物敏感性，P值小于0.05。 3.在Ⅰ类整合酶基因扩增阳性的菌株中，肠杆菌科细菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌中整合子可变区扩增阳性率分别为82.4﹪(70/85)、87.5﹪(35/40)和94.6﹪(53/56)，扩增片段大小从0.15kg到4.0kg不等。在Ⅱ类整合酶基因扩增阳性的菌株中，85.0﹪(17/20)的菌株可变区扩增阳性，大小均为2.2kg。 4.对Ⅰ类整合子可变区进行序列分析提示其含有：氨基糖苷类耐药基因(aadA1，aadA2，aadA5，aadA6，accA4，aac6'-Ib，aadB)、磺胺类耐药基因(dfr2d,dfrV,dfrⅫ,dfr17)、β-内酰胺类耐药基因(blaoxa10,blap1，blaCARB8)、氯霉素耐药基因(cat，catB8，cmlA1-variant)和功能不清的开放阅读框(orfD，orfF,orfI)。Ⅱ类整合子可变区均含有dfrA1-sat1-aadA1基因，分别编码对磺胺类、链丝菌素和氨基糖苷类抗生素的耐药性。 5.经GenBank数据库blast比对，首次检出5种整合子可变区耐药基因组合形式：aadB-cat-blaaxa10/aadA1、aadA6-orfD、aadB-blap1、aadB-aac6-Ⅱ-blaCAB8和orfI-aadA1，已登录GenBank，基因号分别为DQ141319、DQ091179、DQ141316、DQ288251和DQ092497。 另外，有一些整合子可变区基因盒组合形式虽已报道过，但本研究在下列菌株中首次检出了这些基因盒组合形式：在肺炎克雷伯菌中检出aacA4-catB8-aadA1和dfr17-aadA5两种基因盒组合形式，已登录GenBank，基因号分别为DQ141317和AY994155；在肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌中分别检出dfr2d型和dfrV型耐药基因，已登录GenBank，基因号分别为AY968807和AY968808；在铜绿假单胞菌中检出aadA2基因盒，已登录GenBank，基因号分别为DQ091178；在鲍曼不动杆菌中检出dfrⅫ-orfF-aadA2和aadB-cat-blaoxa-10/aadA1两种基因盒组合形式，已登录GenBank，基因号分别为DQ141318和DQ288250。 结论：1.整合酶基因PCR法是进行整合子检测的可靠而理想的方法，RFLP联合DNA测序技术是进行整合子可变区中耐药基因分析的一种快速、价廉的方法； 2.Ⅰ类整合子广泛存在于南京地区肠杆菌科细菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌中，Ⅱ类整合子在志贺菌中流行； 3.肠杆菌科细菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类、β-内酰胺类和喹诺酮类等抗生素的耐药和多重耐药与Ⅰ类整合子的存在明显有关，志贺菌对链霉素、复方新诺明、氯霉素和四环素的耐药与Ⅱ类整合子明显有关，可见，整合子可作为细菌耐药的标记，用于耐药性监测；4.整合子可变区主要含有编码对氨基糖苷类和磺胺类抗生素耐药的基因，并含有少量的β-内酰胺类耐药基因、氯霉素耐药基因和功能不清的开放阅读框，整合子参与了肠杆菌科细菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌的耐药和多重耐药； 5.整合子可变区中的耐药基因对细菌耐药性的形成有重要作用，而本研究在国际上首次报道了5种新型的整合子可变区基因盒组合形式，并在一些菌株中首次检出了7种基因盒或基因盒组合形式，共向GenBank数据库申请到12个基因号。

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