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生物降解聚乳酸-乙醇酸-己内酯载环丙沙星的合成，表征及体外、体内抗菌活性的研究

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摘要

英文缩略语

1 前言

2．1 主要试剂和仪器

2．1．1 主要试剂

2．1．2 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 三元共聚物PLGC的合成

2．2．2 共聚物的体外水解及酶解

2．2．3 1HNMR表征

2．2．4 GPC测试

2．2．5 DSC分析

2．2．6 TGA分析

2．2．7 力学性能分析

2．2．8 载环丙沙星的PLGC复合物制作

2．2．9 环丙沙星浓度标准曲线的绘制

2．2．10 复合物体外释药试验及释药后的形态观察

2．2．11 大鼠骨髓间充质干细胞的传代，冷冻，复苏

2．2．12 复合物的细胞毒性检测

2．2．13 复合物体外释放药物的抗菌活性测定

2．2．14 Wistar大鼠胫骨慢性骨髓炎模型的建立与评价

2．2．15 Wistar大鼠胫骨慢性骨髓炎的治疗及疗效评价

2．2．16 统计学分析

3．1 合成

3．2 结构表征

3．3 热力学性能

3．4 力学性能

3．5 体外水解

3．6 载环丙沙星PLGC复合物的制作结果

3．7 环丙沙星浓度标准曲线的绘制

3．8 PLGC复合物的体外释药实验结果

3．9 复合物释药前后的SEM形态观察

3．10 细胞毒性试验

3．11 抗生素的体外释放实验结果及抗菌活性结果

3．12 大鼠慢性骨髓炎建模型后的评价

3．13 建造模型后，及清创治疗后的肉眼观察评价结果

3．14 体重及化验指标的结果

3．15 治疗后的微生物学检查结果

4 讨论

本研究的创新和自我评价

参考文献

综述 可吸收生物材料载体治疗慢性骨髓炎的研究进展

攻读学位期间取得的科研成果

致谢

个人简历

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摘要

前言:
　　骨髓炎是感染性微生物引起的骨的炎症，是由于微生物感染并导致骨骼破坏的炎症反应过程。慢性骨髓炎的治疗包括手术清除失活，感染组织，骨稳定性重建，消灭死腔，良好的软组织覆盖，骨重建，并联合应用抗生素。长期全身应用抗生素副作用大，难以在病灶局部形成高的抗生素浓度。而局部应用药物可以弥补以上缺点。
　　目前临床批准的聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥链珠载药局部应用治疗骨髓炎虽取得一定的成功，但其仍存在药物释放不完全，易致细菌耐药，需二次取出等缺点。作为改进，人们在科研中应用可吸收生物材料替代骨水泥链珠治疗动物慢性骨髓炎取得了良好的效果。
　　聚乳酸乙醇酸酯是最为常用的聚酯类生物可吸收材料，是良好的局部抗生素载体。但其质硬，可产生大量酸性降解产物。本研究试图在聚乳酸乙醇酸酯中引入丙交酯单体，合成一种酸性降解产物更少，具有弹性的新的三元共聚物，并对其理化性质，载药后体内体外抗菌效果做进一步评价。
　　目的:
　　1.合成PLGC(PLA-GA-CL)三元共聚物，并对其理化性质进行表征。
　　2.以PLGC载环丙沙星形成复合物，进行体外药物释放研究，抗菌效果研究。
　　3.构建大鼠慢性骨髓炎模型，进行PLGC复合物的体内抗菌实验研究。
　　研究方法:
　　1.三元共聚物PLGC的合成:PLGC通过DLLA、GA与CL的的本体开环聚合反应制备而得。所有共聚反应均在130±2℃下进行24h，制成棒状以进行力学实验。
　　2.三元共聚物的体外水解及酶解:将PLGC裁成长为40mm的植入剂，精密称重后将植入剂置于20 mL pH=7.4的PBS溶液中，并置于37℃空气浴中，每天振荡8h，振幅为65次/分，PBS溶液每周更换一次。分别在第1、2、3、4、5、6、7周取出样品，干燥，称重。聚合物降解前后介质的pH通过配备三合一微量电极的pH计进行测试。
　　3.力学性能分析:采用拉力实验机对聚合物的力学性能进行测试，测试标准参照国标GB/T1040.1-2006，夹头速度50mm/min。每种样品平行操作5个样品，结果为平均值。
　　4.PLGC复合物的制作:精确称量5g PLGC三元共聚物，并将其溶解在氯仿中，然后按照药物与载体材料的重量比为1∶10加入环丙沙星药物0.5g，搅拌均匀后，浇铸在培养皿中，待氯仿完全挥发后揭下药膜，干燥至恒重。
　　5.PLGC复合物的体外释放药物检测:取载药颗粒100mg为一组，共3组作为3个平行样品，以空白载体材料PLGC作为空白对照，分别用10mL蒸馏水浸泡，置于（37±1）℃恒温空气浴中振摇，每24h更换一次蒸馏水，在波长271nm处测定释放液的吸收度A，由标准曲线方程计算药物浓度按回归方程计算释药量。
　　6.PLGC复合物释放药物后电镜检测:复合物在未置入生理盐水前，与置入生理盐水30日时的样品干燥后进行电镜扫描观察形态。
　　7.PLGC复合物的细胞毒性检测:大鼠骨髓间充质干细胞购买自广州赛业公司，MTT方法检测BMSCs对PLGC复合物材料浸提液的浓度梯度依赖性。利用不同浓度的浸提液处理细胞，检测MTT的OD值，反映细胞活性。
　　8.PLGC复合物体外释放药物的抗菌活性测定:金黄色葡萄球菌ATCC25923购自上海北诺生物科技有限公司，活化后的金黄色葡萄球菌转接到营养肉汤中，37℃培养24h后，获得108CFU/ml的菌液，用无菌棉拭子蘸取已制备好的金黄色葡萄球菌菌液，均匀涂抹于营养琼脂平板培养基上。在营养琼脂平板上无菌打孔，加入2小时，15日，30日缓冲液100μl进行抑菌环检测。恒温培养24h。读取抑菌环大小。
　　9.Wistar大鼠胫骨慢性骨髓炎模型的建立与处理:实验中所有的手术步骤都经中国医科大学动物伦理委员会批准，严格按步骤执行。10％水合氯醛麻醉后，无菌条件下，显露胫骨近端1/3，以1.0mm直径的电钻钻入胫骨骨髓腔，生理盐水冲洗后以50μl的鱼肝油酸钠注射液注射进入髓腔内，随后以无菌生理盐水配置的金黄色葡萄球菌菌液50μl注射进入髓腔内，再以骨蜡封闭骨髓腔入口。术后4周，3只大鼠处死后行x-ray检查，3只大鼠处死后行HE染色检查。余18只大鼠随机分为实验组，对照组，空白组，行二次手术清创，实验组骨髓腔内植入PLGC复合物，对照组胫骨骨髓腔内植入PLGC，空白组无植入物。每周测量大鼠体重，WBC计数变化至4周，4周时处死大鼠，行病灶处微生物学检查，测量其内细菌含量。
　　10.采用SPSS19.0统计软件包对所得实验数据进行统计分析，计量资料以(x)±S表示，实验组间的对比分析采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
　　结果:
　　1.在所述聚合条件下，所得共聚物具有较高的产率(＞90％)。
　　2.当CL含量为的20mol％和40mol％时，PLGC三元共聚物降解7周后的失重率分别为89.08％和76.74％，而PLGA几乎降解完全。当CL含量为的20mol％和40mol％时，PLGC三元共聚物降解3周后PH值由7.4下降至分别为6.92，7.11，而PLGA值下降至6.46。
　　3.当CL含量由0 mol％增加至40mol％时，PLGC三元共聚物的弹性模量及拉伸强度分别由3136 MPa，51.63 MPa降低至3.7 MPa，1.38 MPa。同时，共聚物由坚硬材料转变为橡胶态材料。
　　4.载药过程属于物理混合过程，对PLGC三元共聚物的性能无影响。
　　5.PLGC复合物可持续，足量释放药物至少33天。
　　6.初始样品表面平整且分散药物颗粒，30天后，释药后的载药复样品较容易脆裂，载药样品表面及内部出现了大小不一的凹坑和孔洞。
　　7.各个实验组与对照组之间结果SPSS统计之后无统计学差异。证明PLGC复合物没有细胞毒性，具有良好的生物相容性。
　　8.PLGC复合物在2小时时释放的环丙沙星溶液抗金黄色葡萄球菌的抑菌环大小为34.0±0mm，4小时，15天，30天时释放的环丙沙星溶液产生的抑菌环大小分别为18.33±1.25mm,13.33±2.33mm，26.0±0mm，所释放的药物在检验的时间点均具有抗菌活性。
　　9.x-ray及HE染色结果均证实，在骨髓炎模型建造4周后大鼠胫骨内形成了明确的慢性骨髓炎，二次行清创术后，将PLGC复合物植入实验组大鼠体内，治疗4周后实验组大鼠体重回升，WBC明显降，与对照组及空白组差异均有统计学意义。微生物学检测结果显示，实验组大鼠病灶内细菌含量明显减低，与对照组及空白组差异均有统计学意义。
　　结论:
　　PLGC聚合物有着与PLGA相似的特征，可以替代PLGA作为药物载体。但其有低酸性的特点，可降低病灶局部的炎性反应，也是对PH值敏感型的抗生素的更佳载体。因其弹性较PLGA更好，易于自骨缺损处植入骨髓腔内，易于术中根据需要裁剪。甚至可以直接植入窦道软组织内，不会引起不适。

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