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高糖环境下大鼠DRG神经元中TRPV4和PKCε的表达

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背根神经节(dorsal root ganglion，DRG)为感知机体内外环境刺激的重要部位，对感觉信息起放大和精细微调作用。当外周神经受到损伤时，DRG神经元产生自发性持续性异常放电，而异位放电则是痛觉异常的电生理学基础。DRG处异位电活动的发生与DRG神经元内游离Ca2+浓度有密切相关性。瞬时感受器电位(transient receptor potential，TRP)离子通道受到伤害性刺激后引起Ca2+内流增加，从而导致痛觉异常。瞬时感受器电位离子通道香草素受体4(Transientreceptor potential vanilloid4，TRPV4)是TRP亚家族成员之一，对钙的通透性较高，并且在感受伤害的DRG神经元中高表达，可感受低渗刺激、机械刺激、温度(＞27℃)、低pH等多种理化刺激而在神经性疼痛中的作用越来越受到重视。目前持续高糖刺激对DRG神经元内TRPV4表达是否有影响尚未明确。
　　 蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)作为重要的信号转导分子，与各种疼痛机制有着直接或间接的联系。蛋白激酶Cε(protein kinase Cε，PKCε)属于PKC家族新型亚家族成员之一，为非钙依赖而对佛波酯或二酰基甘油(diacylglycerol，DAG)敏感的丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶。持续高糖刺激明显增加细胞内从头合成DAG含量，但是高糖刺激是否引起PKCε表达上调，目前没有明确的定论。PKC的激活可以引起TRPV4通道的敏化，进而引起痛觉过敏。PKCε参与疼痛信号的传导是否与TRPV4有关，目前尚无定论。PKC除了通过磷酸化下游底物参与疼痛信号传导外还参与细胞的转录及翻译调控，但持续高糖刺激下PKCε对TRPV4表达是否有调节作用，目前尚不明确。因此，本研究通过体外高糖培养DRG神经元，模拟糖尿病环境，观察持续高糖刺激对TRPV4、PKCε基因和蛋白表达的影响，明确高糖刺激下TRPV4的激活是否依赖PKCε的参与，进而探讨痛性糖尿病神经病变（painful diabetic neuropathy, PDN）发生发展可能的分子机制，为PDN治疗及新的临床用药提供理论与实验依据。
　　 实验方法：
　　 采用原代培养的新生大鼠DRG神经元。神经元在正常糖环境下培养48 h后换含有不同浓度培养基培养并同时给予Enzastaurin处理。根据培养基含糖浓度的不同以及是否给予Enzastaurin，原代培养的神经元分为6组:空白对照组(C组，糖浓度为5.5 mM)、中糖组（M组，糖浓度为17.5 mM）、高糖组(H组，糖浓度为35.0 mM);C给药组（C+E组，5.5 mM葡萄糖+110 nM Enzastaurin）、M给药组(M+E组，17.5 mM葡萄糖+110 nM Enzastaurin)、H给药组(H+E组，35.0 mM葡萄糖+110 nM Enzastaurin)。用不同浓度葡萄糖以及Enzastaurin处理神经元48 h后检测神经元TRPV4和PKCε基因和蛋白的表达:①用RT-PCR和Real-time PCR分别对TRPV4和PKCε mRNA进行定性定量分析;②用免疫荧光法定性定位分析TRPV4和PKCε蛋白表达;③Western blotting检测TRPV4和PKCε蛋白表达变化。
　　 应用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。所有数据均用x±s表示，组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
　　 实验结果：
　　 1.大鼠DRG神经元中TRPV4 mRNA的表达为了验证高糖环境下DRG神经元中是否有TRPV4 mRNA的表达，首先用RT-PCR进行定性分析，发现各组神经元中均有TRPV4 mRNA表达，而且高糖环境下表达强度有一定的增强趋势。所以为了确保定量的准确性，用Real-timeqPCR定量分析大鼠DRG神经元中TRPV4 mRNA的表达。Real-time qPCR结果显示，与C组比较，M组TRPV4 mRNA表达明显增高，为C组的2.28倍，差异有显著性(P＜0.01);H组表达差异没有统计学意义(P＞0.05)。用Enzastaurin处理DRG神经元后，与相应未给药组比较，C+E组、M+E组、H+E组TRPV4mRNA表达均有不同程度降低，分别降低27.00％、44.74％和45.45％，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 2.大鼠DRG神经元中PKCε mRNA的表达用RT-PCR进行定性分析，并用Real-time qPCR定量分析大鼠DRG神经元中PKCεmRNA的表达。Real-time qPCR结果显示，与C组比较，M组PKCε mRNA表达没有统计学意义(P＞0.05);H组PKCε mRNA表达明显增高，为C组的1.41倍，差异有显著性(P＜0.01)。用Enzastaurin处理DRG神经元后，与相应未给药组比较，C+E组、M+E组、H+E组PKCε mRNA表达差异没有统计学意义（P＞0.05）。
　　 3.大鼠DRG神经元TRPV4蛋白表达细胞免疫荧光结果显示，在C组DRG神经元细胞核区域TRPV4蛋白表达相对较强，胞浆表达相对微弱，然而在持续高糖刺激（M组、H组）下TRPV4蛋白具有在细胞核区域表达变弱、胞浆表达变强的趋势。用Enzastaurin处理DRG神经元后，C+E组、M+E组、H+E组TRPV4蛋白在胞核区域表达相对较强，胞浆表达相对较弱。DRG神经元荧光强度分析结果显示，与C组比较， M组、H组TRPV4蛋白表达增强，差异有统计学意义(P＜0.05);与相应未给药组比较，C+E组、M+E组、H+E组TRPV4蛋白表达明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。
　　 4.大鼠DRG神经元PKCε蛋白表达细胞免疫荧光结果显示，C组和C+E组PKCε蛋白胞浆区域表达相对较强，胞核表达相对微弱;然而在M组、M+E组、H组、H+E组中胞浆、胞核表达具有明显增强的趋势，其中胞核表达增强趋势最明显。荧光强度分析结果显示，与C组比较，M组、H组PKCε蛋白表达增强，差异有统计学意义(P＜0.05);与相应未给药组比较，C+E组、M+E组、H+E组TRPV4蛋白表达差异没有统计学意义（P＞0.05）。
　　 5.大鼠DRG神经元中TRPV4蛋白的表达Western blot分析结果显示，持续高糖刺激明显增加DRG神经元TRPV4蛋白的表达，与C组比较，M组和H组TRPV4蛋白表达增加显著，分别为C组的5.72倍、12.98倍，差异有统计学意义(P＜0.01)。用Enzastaurin处理DRG神经元后，与相应未给药组比较，C+E组、M+E组、H+E组TRPV4蛋白表达均降低，分别降低22.22％、40.59％、41.28％，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 6.大鼠DRG神经元中PKCε蛋白的表达Western blot分析结果显示，持续高糖刺激明显增加DRG神经元PKCε蛋白的表达，与C组比较，M组和H组PKCε蛋白表达增加显著，分别为C组的1.11倍、1.98倍，差异有统计学意义(P＜0.05)。用Enzastaurin处理DRG神经元后，与相应未给药组相比，C+E组、M+E组、H+E组PKCε蛋白表达差异没有统计学意义(P＞0.05)。
　　 结论：
　　 1.持续高糖刺激诱导TRPV4的表达，而且有一定的浓度依赖性。
　　 2.高糖环境下PKCε调节TRPV4基因和蛋白的表达。

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