黑线仓鼠KiSS-1/GPR54系统在季节性繁殖与光周期调控中的作用

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黑线仓鼠(Cricetulus barabensis)是一种典型的季节性繁殖动物,也是华北地区农业害鼠的优势种,高繁殖力是影响其种群数量波动的主要原因之一,因此研究黑线仓鼠的季节性繁殖调控机制显得尤为重要。本文从繁殖调控相关基因KiSS-1和GPR54入手,从分子水平上揭示害鼠种群数量季节性波动机制,对鼠害的综合防控提供新的思路。KiSS-1是与动物繁殖行为密切相关的基因,其编码产物Kisspeptins通过与GPR54结合发挥调节功能,KiSS-1/GPR54系统不仅介导了光周期对繁殖的调节,还影响着动物的青春期启动、发情周期维持以及探究、攻击、择偶等多种行为。本研究通过RT-PCR的方法克隆黑线仓鼠的KiSS-1和GPR54 cDNA序列,并使用生物信息学的分析方法预测蛋白质的分子结构及功能,结合多个物种的相应序列进行分子系统进化研究,采用实时荧光定量的方法分别检测两者在不同发育阶段、不同发情周期和不同组织器官中的表达情况,预测KiSS-1/GPR54在黑线仓鼠生长、发育以及繁殖过程中所起的作用,从分子生物学角度寻找控制黑线仓鼠数量及其危害的有效方法。
　　本研究克隆拼接获得完整的KiSS-1和部分GPR54的cDNA序列。其中,KiSS-1 cDNA序列558bp,包含完整的CDS区和3￠端,GenBank登录号:JQ219667;GPR54 cDNA序列578bp,全为编码区序列,GenBank登录号:JQ685855。采用生物信息学方法对两基因的核苷酸序列和相应的氨基酸序列进行分析,并预测其蛋白质二级、三级结构。研究结果表明:KiSS-15￠端编码的MTALASWQLLLLLCVTIFG19个氨基酸是Kisspeptins的信号肽序列,NWNSFGLRY氨基酸残基构成成熟的Kisspeptin-10分子,67位的-R和121-122位的-RR是可能的水解位点,其蛋白质二级结构中含有较多的α螺旋,对Kisspeptins功能的发挥有重要意义,同时应用CPHmodel程序预测得到了KiSS-1的三级结构。扩增得到的GPR54编码区序列涵盖了完整的7个跨膜α螺旋中的前四个螺旋,包括两个胞内环和两个胞外环,在第4外显子处存在一处可能的可变剪接位点,并用SWISS-MODEL程序预测得到了该蛋白质三级结构。使用Clustal2.0分别将黑线仓鼠KiSS-1和GPR54 cDNA序列与金仓鼠(Mesocricetus auratus)、大鼠、小鼠、人等多个物种的相应cDNA序列进行同源性对比分析,并使用MEGA5.0构建系统进化树,聚类分析表明,黑线仓鼠与金仓鼠亲缘关系最近,与大鼠、小鼠较近,与偶蹄目和灵长目的几个物种亲缘关系均较远。
　　随后,本研究分别比较了KiSS-1和GPR54在雌雄黑线仓鼠亚成年期、成年发情期以及老年期三个发育时期下丘脑和生殖器官(♀:卵巢、子宫;♂:睾丸、附睾)中的相对表达量。结果发现:KiSS-1和GPR54在下丘脑和生殖器官中均有表达,但两基因的表达模式在不同发育时期和不同器官中表现并不同。KiSS-1和GPR54在雌性亚成体中表达明显高于其他各发育时期,发挥了显著的作用,这与 KiSS-1/GPR54系统能激发幼体青春期发育的研究结果相一致。KiSS-1和GPR54发挥生理作用的部位随发育时期的不同会发生迁移,幼年时期主要在中枢器官发挥功能,成年期之后逐渐向外周器官(以旁分泌方式发挥作用)转移。这与已有的关于KiSS-1青春期发育启动的神经内分泌调控机制相一致。不同发情周期中,中枢和外周器官的KiSS-1和GPR54表达量也并不相同。成年雌鼠下丘脑KiSS-1的表达呈现脉冲式周期波动,发情间期表达较少,在发情前期达到高峰,发情期、发情后期表达略有减少,GPR54仅在发情前期和发情期表达显著增高,因此推测发情周期的维持方面,KiSS-1和GPR54可能存在不同的调节模式,两者的结合调控可能表现出与KiSS-1表达相一致的“剂量依赖”关系,且卵巢等处KiSS-1表达峰滞后于下丘脑的KiSS-1表达峰,推测这可能是与调控的精确性和时序性相适应的结果。
　　实验通过模拟自然光照的变化,研究了不同光周期影响下雌雄黑线仓鼠在生理、生态、分子遗传学的变化。结果说明,长光周期及渐长光周期对黑线仓鼠的繁殖有促进作用,短光周期和渐短光周期对黑线仓鼠体重、静止代谢、自发行为、攻击行为等方面的抑制作用较为显著。激素检测结果显示,雌性黑线仓鼠褪黑激素的含量与下丘脑 KiSS-1的mRNA表达量呈显著负相关,血清和粪便样品中的雌激素含量与卵巢KiSS-1的mRNA表达量呈正相关。雌性黑线仓鼠KiSS-1的调控途径在不同渐变光周期下可能存在不同,渐长光周期下主要集中在中枢神经处,而渐短光周期和对照光周期时,由于中枢神经的褪黑激素抑制作用加强,KiSS-1的调控作用逐渐向外周调控途径转变。在这两种器官中,GPR54表达变化均与卵巢中KiSS-1的表达方式相近。综上所述,研究KiSS-1/GPR54对动物繁殖行为的调节不能孤立地研究KiSS-1和GPR54的分子结构及其表达量的变化,应结合与其驯化条件、生理时期综合考虑。
　　本研究通过实验室模拟光周期变化与分子生物学研究方法相结合,从分子的角度初步分析了调节黑线仓鼠季节性繁殖周期节律的遗传机制,为进一步深入的研究季节性繁殖的调控机制提供了理论依据。

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作者
张强;
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作者单位

曲阜师范大学;

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授予单位曲阜师范大学;
学科动物学
授予学位硕士
导师姓名徐来祥,徐金会;
年度 2013
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类仓鼠科;
关键词
黑线仓鼠; 农业害鼠; 季节性繁殖; 光周期调控; 种群数量; 综合防控; GPR54 cDNA序列;

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2. 新的生殖激素调控系统——KiSS-1/GPR54 [J] . 王雪松 ,汤军 ,崔毓桂 . 国际生殖健康/计划生育杂志 . 2006,第004期
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