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猪博卡病毒类病毒颗粒的表达以及在流行病学方面的应用

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综述 猪博卡病毒的研究进展

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摘要

目的：
　　利用杆状病毒表达系统(Baculovirus expressing system)，在昆虫Tn5细胞中表达PBoV的主要构造蛋白VP2,以期获得PBoV的类病毒颗粒(PBoV-LPs)。以PBoV-LPs为抗原，建立酶联免疫法(ELISA)，检测抗-PBoV抗体，进而探讨PBoV的血清流行病学的特征。同时研究PBoV的免疫原性及免疫反应性，为PBoV疫苗的研制开发奠定基础。也为未知病毒的抗原性的研究建立一套研究体系和研究模型。
　　方法：
　　1.运用PCR法，扩增PBoV的VP2基因，将VP2基因克隆到TA克隆载体，并进行大量扩增。
　　2.构建VP2基因转移载体pVL1393-VP2,与线性化的杆状病毒DNA，一起转染昆虫细胞Sf9,得到重组杆状病毒Ac[VP2]。之后，在Sf9细胞中，使其大量扩增。
　　3.将重组杆状病毒Ac[VP2]，感染BTL-Tn5B1-4(Tn5)细胞，进行蛋白表达。动态观察蛋白表达:将细胞内的蛋白、上清中的蛋白进行SDS-PAGE电泳，考马氏亮蓝(Coomassie blue)染色后，观察细胞内蛋白的表达，以及培养上清中蛋白的分泌，以确定回收蛋白的时间。
　　4.收集培养7天后细胞上清液，离心、4℃重悬过夜后，进行CsC1密度梯度离心纯化蛋白。用蛋白测序方法，检测蛋白质N端氨基酸序列，验证VP2蛋白的准确性。Uranyl acetate染色后，电镜下观察类病毒颗粒。
　　5.将PBoV-LPs免疫家兔，获取抗PBoV-LPs抗体。利用该抗体和其它病毒颗粒的免疫反应，来确认PBoV-LPs与HBoVs、以及PCV2-LPs的交叉反应性。
　　6.建立抗体检测的方法，通过检测家猪和野猪血清中抗PBoV IgG抗体，了解PBoV的流行病学状况。
　　7.检测家猪和野猪血清PBoV的DNA，明确家猪和野猪中流行的PBoV的分子生物学特征。
　　结果：
　　1.重组杆状病毒AC[VP2]感染的Tn5细胞中，检出PBoV VP2蛋白，其分子量约为61.5KDa，细胞内蛋白的表达高峰，在感染后第三天到第五天，之后开始递减;上清液中的蛋白，在感染后第三天开始检测到，之后逐渐增多;感染后第7天，上清液中蛋白量达到高峰。
　　2.感染后第七天收集细胞培养上清液，CsCl密度梯度离心法纯化蛋白。分子量约为61.5KDa的蛋白质集中在收集管8,9,10，密度为1.300g/cm3。电镜下观察到直径约为30nm的类病毒颗粒，形状和原始病毒相似。蛋白质序列分析显示，类病毒颗粒的N端5个氨基酸序列，与PBoV VP2蛋白的序列完全一致。说明VLPs是由PBoV VP2基因表达而来，而且PBoV VP2蛋白可以自行装配成类病毒颗粒(VLPs)。
　　3.为验证病毒颗粒内部是否包被了核酸，利用MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit(Roche Applied Science)试剂盒，从类病毒颗粒中提取核酸，然后将提取物进行琼脂糖凝胶电泳，进行观察。结果显示颗粒内部未检测到核酸。
　　4.将病毒颗粒免疫家兔，进行ELISA试验，检测抗体的效价。比较免疫前后兔血清中的抗体，免疫前兔血清中未检出抗体;免疫后的兔血清中，抗PBoV-LPsIgG抗体的滴度高达1∶409,600，说明PBoV-LPs具有良好的免疫原性。
　　5.PBoV与HBoVs的抗原性比较:通过ELISA法检测抗PBoV-LPs抗体与HBoV-LPs、抗HBoV-LPs抗体与PBoV-LPs的交叉反应性，来比较PBoV与HBoVs的抗原性的差别。发现兔抗-PBoV IgG与HBoV1-LPs和HBoV2-LPs均反应，但不与HBoV3-LPs和HBoV4-LPs反应。而PBoV-LPs，可与兔抗-HBoV1,2,3,4-LPs IgG发生交叉反应，但弱于同源抗原抗体间的反应。说明PBoV可与HBoVs之间有相同的抗原决定簇存在。PBoV-LPs不与兔抗-PCV2-LPs IgG反应，PCV2-LPs也不与兔抗-PBoV-LPs IgG发生反应，说明PBoV与PCV2抗原性完全不同。
　　6.家猪和野猪的抗PBoV IgG抗体携带率:以PBoV-LPs作为抗原进行ELISA试验检测抗体。检测了194份家猪和259份野猪血清，其结果，家猪血清抗体阳性率高于90.7％(176/194)，野猪血清抗体阳性率平均为59.5％(154/259)，证明PBoV的感染在家猪和野猪中是很普遍的现象。
　　7.PBoV的病毒核酸检测:利用巢式PCR扩增PBoV NS1部分基因，调查家猪及野猪的病毒携带状况。从259份野猪血清中共检出7份血清PBoV DNA阳性，其中兵库县采集的血清中有4份，茨城县2份、长崎县1份。核苷酸序列分析结果表明，这7例病毒DNA属于PBoV G3型基因组，并可以细分成4个亚型基因组，有明显的地域区别。家猪血清样本中，并未检出病毒DNA，其原因在于，90％以上的家猪都已有抗体，病毒已被清除。
　　结论：
　　1.本课题成功地利用杆状病毒表达体系，合成了猪博卡病毒类病毒颗粒(PBoV-LPs)，并完成类病毒颗粒的鉴定，包括蛋白的表达量、直径、电镜形态、分子量、颗粒密度、和免疫原性等生物学指标。PBoV-LPs猪博卡病毒类病毒颗粒具有天然VP2蛋白的特性及免疫原性，可作为抗原用于抗体的检测以及疫苗的研制。
　　2.应用纯化的PBoV-LPs作抗原，建立了抗体检测的ELISA方法。并用此方法对PBoV的抗原性进行了比较。发现PBoV可与HBoVs发生交叉反应，PBoV与PCV2的抗原性完全不同。
　　3.对家猪和野猪的PBoV的感染状况，进行了流行病学调查:发现在家猪和野猪中，PBoV的感染都很普遍。家猪的感染率更高，和饲养环境有密切关联。从野猪标本中检出的PBoV DNA序列分析表明，PBoV的感染存在多样化、地域性差异等特点。

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