抗汉坦病毒鼠/人嵌合抗体真核表达载体的构建及表达

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汉坦病毒（Hantavirus）属于布尼亚病毒科汉坦病毒属，根据其抗原性和基因结构的不同，可分为10多个型别。Hantavirus可引起两种类型的急性传染病，一类以高热、弥漫性肺部炎症和急性呼吸衰竭为主要表现，称为汉坦病毒肺综合征（hantavirus pulmonary syndrome，HPS），另一类以出血、高热、肾功能损害为主要表现，称为肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS）。迄今为止，在我国尚未发现HPS的报道，但我国是世界上受HFRS危害最严重的国家。该病在我国具有发病人数多、流行范围广、死亡率高等特点。此外，Hantavirus还是一种潜在的生物战剂，有被恐怖分子利用的可能。而且目前临床上尚未有能特异治疗HFRS的有效药物，因而更增加了HFRS的艰巨性和长期性。
　　用疫苗进行主动免疫和用抗体进行被动免疫治疗是当前预防和治疗病毒性疾病的重要措施。近年来国内外已研制出Hantavirus的纯化细胞培养灭活疫苗和纯化乳鼠脑灭活疫苗，但这两类疫苗在试用过程中表现出明显不足。使用具有中和活性的单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)是在体内、外抑制或阻断病毒感染的有效的治疗方法之一。早在上世纪八十年代中期本实验室即研制出具有较高中和活性和保护性的抗Hantavirus mAb，并在国家863计划支持下研制注射用抗HFRS病毒单克隆抗体制剂，现已完成临床试验。由于鼠源性mAb对人有潜在的免疫原性，可能引起超敏反应等副作用，因此，本课题拟在此基础上对抗Hantavirus鼠源性mAb 3G1进行人源化改造，应用基因重组技术，构建鼠/人嵌合抗体基因，在哺乳动物细胞中表达并筛选出稳定高效表达嵌合抗体的细胞系，纯化表达的嵌合抗体并鉴定其生物学特性，为进一步研制特异治疗HFRS的新型制剂奠定基础。
　　1.构建抗汉坦病毒鼠/人嵌合抗体的真核表达载体
　　以pCI-neo-M和pCI-M载体为基础，用ease2.1-cmv5分别替换pCI-neo-M和pCI-M的启动子MARs-mCMV改建真核表达载体，改构后的载体命名为pCI-neo-ease2.1-cmv5-M和pCI-ease2.1-cmv5-M；获得抗HTNV mAb 3G1的鼠/人嵌合轻链、重链基因，并分别将其克隆到pCI-neo-ease2.1-cmv5-M和pCI-ease2.1-cmv5-M真核表达载体中，经双酶切鉴定后分别获得阳性重组质粒pCI-neo-ease2.1-cmv5-vh-M和pCI-ease2.1-cmv5-vl-M，测序后证实载体构建成功。
　　2.稳定表达抗汉坦病毒鼠/人嵌合抗体CHO-K1细胞系的建立与筛选
　　将上述含抗Hantavirus mAb 3G1鼠/人嵌合重链和轻链基因表达载体的JM-109扩大培养后提取质粒，用紫外分光光度计定量,用脂质体法按Lipofectamine TM 2000说明书转染野生型CHO-K1细胞，在氨甲喋呤(MTX)和G418双重筛选压力下筛选稳定、高效表达抗Hantavirus嵌合抗体的细胞株，ELISA方法测定重组蛋白的表达。
　　3.抗汉坦病毒鼠/人嵌合抗体的表达、鉴定及生物学活性检测
　　扩大培养上述筛选出的稳定、高效表达嵌合抗体的细胞系，收集其培养上清，超滤浓缩、除盐后，用Protein AHP Spin Trap纯化试剂盒纯化。纯化后进行SDS-PAGE和Western blot检测，结果表明成功表达了抗Hantavirus鼠/人嵌合抗体。通过体外中和实验检测其中和活性，结果显示该嵌合抗体具有良好的中和活性，其中和活性与亲本抗体的中和活性相近。本实验为抗Hantavirus鼠/人嵌合抗体的进一步研究和临床应用奠定了基础。

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作者
张晓晓;
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作者单位

第四军医大学;

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授予单位第四军医大学;
学科微生物学
授予学位硕士
导师姓名吴兴安,阎岩,王芳;
年度 2012
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类人体病毒学（致病病毒）;病毒性出血热;
关键词
汉坦病毒; 真核表达载体; 生物学活性; 基因重组; 急性传染病;

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