两种核糖体肽类天然产物的生物合成机制研究

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Pantocin A(PA)是由成团泛菌产生的一种能够通过抑制L-组氨醇磷酸氨基转移酶活性从而阻断组氨酸的生物合成RiPPs类天然产物，因此具有良好的抗导致果树等火叶病的致病菌解淀粉欧文氏菌活性(Erwinia amylovora)。在2003年国外课题组已经对PA的分子结构，生物合成基因簇和可能的生物合成机制进行相关报道，但PA生物合成的体外生化表征一直未见发表。鉴于PA分子独特的分子结构及其重要的生物活性，本文拟对PA的生物合成关键催化机制进行研究。我们从P. agglomerans基因组中成功克隆到参与PA分子生物合成的两个关键基因paaA和paaB,随后将paaA和paaB分别因克隆至pET28a表达载体，获得表达质粒并分别转化E.coli BL21进行蛋白诱导表达、亲和纯化。随后将化学合成的前体肽PaaP作为反应底物，拟对PaaA和PaaB蛋白进行生物活性测试，与此同时国外研究组率先发表了PaaA在PA合成过程中通过Claisen缩合和脱羧形成双环核心，鉴于此，我们拟对PaaA/B蛋白的晶体结构进行解析，为深入揭示PaaA/B的催化机制奠定基础。
　　Sactipeptide是由核糖体合成并经过翻译后修饰的一类多肽类天然产物，可表现出多种生理活性，此类化合物特有的标志是在它们分子内部存在一组或多组由半胱氨酸的巯基与另一氨基酸α-碳原子受体形成硫醚键。目前报道的Sactipeptide天然产物多来自于好氧芽孢杆菌，但通过生物信息学分析，我们发现在某些厌氧菌如拜氏梭菌（C. beijerinckii）中也发现了类似Sactipeptide生物合成基因簇。本课题中，我们将该基因簇中前体肽和修饰酶基因同时克隆至pRSFduet-1载体，并在在大肠杆菌中进行异源共表达，对表达宿主进行细胞裂解及亲和纯化，电泳检测后质谱鉴定纯化产物，检测到与预期分子量6372.19相差6.68Dal，根据SacA的氨基酸序列，推测可能是前体肽SacA分子内的7个Cys形成3组分子内二硫键而导致分子量减少6Dal。最后对修饰后的肽类进行质谱检测和分析，推测得到三组分子内形成不同二硫键和分别水解掉一个氨基酸的肽，对这些新多肽的结构鉴定和活性测试工作仍在进行中。

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作者
张晨曦;
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作者单位

上海师范大学;

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授予单位上海师范大学;
学科微生物学
授予学位硕士
导师姓名陶黎明;
年度 2017
页码
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类基础理论;
关键词
核糖体肽类; 异源表达; 天然产物; 生物合成; 分子结构;

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