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柯萨奇病毒B组3型在ECV304中持续感染模型的建立及其持续感染机制的初步研究

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前言

第一部分 CVB3在ECV304细胞中持续感染模型的建立

一、材料

二、方法

三、结果

第二部分 CVB3在ECV304细胞中持续感染的机制研究

一、材料

二、方法

三、结果

1.各片段酶切鉴定结果

2.模型细胞中CVB3变异情况

3.模型细胞中提取的CVB3与建模前CVB3RNA逆转录后Cdna测序结果经过DNAStar比对

4.建模前后CVB3 ORF翻译后氨基酸比对

5.模型细胞中提取的CVB3与建模前CVB3的部分测序图

结论

讨论

参考文献

致谢

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摘要

尽管CVB3是常见的病毒性心肌炎等急性疾病的病原体,然而也有许多证据表明CVB3也参与了许多严重的慢性疾病的病理过程。有研究表明CVB3与扩张型心肌病关系密切,说明病毒可能在心血管系统中持续存在,本文旨在通过建立CVB3(Nancy)在ECV304细胞中持续感染的模型,初步探索CVB3持续感染的机制。 以10<'-1> TCID50, 10<'-2> TCID50, 10<'-3>TCID50 CVB3感染ECV304,建立持续感染细胞模型,稳定传代120天以上,上清液及细胞裂解液接种敏感细胞Vero没有CPE,核酸检测结果阳性,从细胞裂解液中提取病毒RNA,进行RT反应,反转录出基因组cDNA,将整个基因组划分为5段进行PCR扩增,连接目的片段至PGM-T载体,进行测序,分析可能存在的变异是否与持续感染状态的形成有关。 结果发现持续感染细胞中CVB3与建模前的CVB3存在16处核苷酸变异,1处位于5’NTR:16R-G,其余15处位于病毒的ORF,其中有7个核苷酸变异造成了氨基酸的改变,分别是:Pl-A区16P-G、18K-N,P3-AB区1486H-Y,P3-C区1696E-K,P3-D区1745R-K、1849A-T、2098P-L。经过对文献中病毒基因的分析P3-AB区、P3-D区的改变最可能影响病毒的毒力,致病毒表现出一种低复制的表型,这一结论尚需要反向遗传学验证。

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