水产养殖动物重要病原菌等温扩增芯片技术的研究

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水产养殖规模的不断增大及养殖环境和养殖水体污染的日益加剧，使得水产动物疾病暴发日趋频繁和严重。副溶血弧菌(Vibrio parahaemozyticus)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、河流弧菌(Vibrio fluvialis)、轮虫弧菌(Vibrio rotiferianus)、单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）及海豚链球菌（Streptococcus iniae）等9种致病菌广泛存在于水产品和养殖水体中，对人体健康和水产动物造成了严重威胁。因此，需要建立快速有效的方法和手段实现水产养殖过程中致病菌的早期检测、养殖环境的实时监控和预警。
　　本论文首先通过环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）联合横向流动试纸条（lateral flow dipstick，LFD），建立了LAMP-LFD技术，能够在50 min时间内分别完成对单核细胞增生李斯特菌、海豚链球菌和创伤弧菌的快速检测，其灵敏度达到了3.2×101 cfu/mL或0.64 cfu/反应、8.7×101 cfu/mL和3.7×102 cfu/mL或7.4 cfu/反应。参考单核细胞增生李斯特菌、海豚链球菌和创伤弧菌确定的LAMP反应体系和反应条件，并结合已公布的副溶血弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌，确定了LAMP反应的统一体系和条件，并据此筛选出哈维氏弧菌、河流弧菌和轮虫弧菌的最适引物组合。进而又将 LAMP技术与微流体芯片技术联合应用，建立了可同时检测副溶血弧菌等9种病原菌的环介导等温扩增微流体芯片检测技术。该技术操作简单，使用200μL的移液器可实现一次性加样。可特异性检出9个病原菌，对嗜水气单胞菌等其他病原菌的检测为阴性。该方法的检测灵敏度范围为0.40-8.91pg/反应，在35min内即可完成对病原菌的检测，而且稳定性良好。对80份野外临床样品检测结果表明，与传统的微生物学方法相比，该方法临床灵敏度和特异性分别是96.3％和93.8%。该方法可用于细菌的多重检测，在水生动物重要病原菌的现场筛选和常规监测方面具有重要的应用前景。

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作者
王瑞娜;
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作者单位

宁波大学;

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授予单位宁波大学;
学科渔业
授予学位硕士
导师姓名陈炯;
年度 2015
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类各种鱼的病害、敌害及其防治;
关键词
水产养殖动物; 病原菌; 等温扩增芯片; 李斯特菌; 海豚链球菌; 创伤弧菌; 早期检测;

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