mGluR5拮抗剂MPEP对FMR1基因敲除小鼠神经元树突棘的影响及机制探讨

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脆性X 综合征是最常见的遗传性智力低下性疾病之一，临床症状表现为不同程度的智力低下、注意力缺陷、强迫症、自闭症等。FMR1 基因(fragile X mentalretardation 1)三核苷酸重复序列异常扩增，使其编码产物脆性X智力低下蛋白(fragile X mental retardation protein，FMRP)减少或缺失而致病。研究发现脆性X综合征患者和FMR1基因敲除小鼠都存在树突棘发育异常。由于树突棘是突触后膜的主要结构，因此普遍认为树突棘形态异常导致的突触可塑性改变可能是导致脆性x综合征临床表现的病理基础。现在已证实FMRP是一种翻译抑制因子，它特异性与某些mRNA结合抑制其蛋白的表达，推测FMRP可能通过调节与神经系统发育有关的蛋白合成来发挥作用。已证实FMRP蛋白包含有MAP1B mRNA结合位点，也有研究表明脆性 X 综合征果蝇和小鼠模型脑组织中微管相关蛋白1B(microtubule associated protein 1B，MAP1B)的含量增加，增加的MAP1B与树突棘的发育密切相关，推测FMRP可能通过调节MAP1B的表达影响树突棘的形态。由于脆性 X 综合征第1组代谢性谷氨酸受体 (metabotropic glutamatereceptor I，mGluR I)依赖的蛋白翻译增强；mGluR I激动剂能使海马神经元产生类似于FMR1基因敲除小鼠的树突棘改变，并导致实验动物产生脆性 X 综合征相似的临床症状；因此推测mGluR I过度激活所致的神经发育蛋白过表达可能在脆性综合征发病机制中发挥重要作用。最近的研究显示mGluR I抑制剂能够部分逆转脆性X综合征小鼠模型行为异常，改善脆性X综合征果蝇模型求偶能力和蘑菇型树突棘缺陷；我们的前期研究结果也己证实抑制mGluR I能部分逆转培养FMR1基因敲除小鼠神经元树突棘形态异常和MAPlB表达异常。这些结果进一步说明脆性X综合征存在mGluR I过度激活。然而，脆性 X 综合征树突棘的形态异常是否由于mGluR I过度激活使MAPlB过表达所致，在体的情况下mGluR I拮抗剂是否也可以逆转FMR1基因敲除小鼠树突棘发育异常，不同干预时机和干预时间的长短对树突棘发育有无影响，有待进一步研究。mGluR I包括mGluR1和mGLuR5两种亚型，最近的几项研究提示mGlLuR5可能在脆性X综合征的发病机制中发挥更重要的作用。因此，本研究通过给予新生和成年FMR1基因敲除小鼠mGluR5特异性拮抗剂MPEP处理，观察mGluR5功能改变对树突棘发育和MAP1B表达的影响，初步探讨mGluR5在脆性X综合征发病机制中的作用及机理；同时通过在体条件下观察MPEP不同干预时机和干预时间长短对树突棘发育的影响，为寻找有效的治疗方案提供一定的依据。材料与方法： FVB品系小鼠饲养在19～21℃自然光条件下，自由获取食物和水分。实验前取尾静脉血提取DNA，PCR技术进行基因型鉴定。将新生1天和出生6周(成年)的雄性FMR1基因敲除(FMR1 knockout，KO)小鼠分别随机分为干预1周组(KOtlw)和1周空白对照组(KOclw)、干预2周组(KOt2w)和2周空白对照组(KOc2w)。并以同龄野生小鼠(wild type mouse，WT)作为野生对照组(WTclw、WTc2w)。干预组分别于新生1天和出生6周开始给予腹腔注射MPEP 20mg/(kg．d)，两对照组则予等量生理盐水腹腔注射，每天1次。新生K0小鼠增设MPEP干预1天组(KOtld)，自出生第1天开始注射生理盐水，第7天给予MPEP注射1次。以上各组注射时间固定于上午10：00～11：00。新生小鼠每组10只，Golgi染色和免疫印迹两种试验方法各用5只；成年小鼠每组5只，用于Golgi染色。用于Golgi染色的实验小鼠在接受最后1次注射3 h后取脑，以单片Golgi染色方法观察树突棘的长度、密度和形态。用于免疫印迹的新生小鼠于最后1次注射3h后抽取全脑蛋白，用免疫印迹方法检测MAP1B的表达。结果： 1．KO和WT小鼠树突棘特点在新生和成年KO鼠的空白对照组(KOc，包括KOclw和KOc2w)与同龄野生对照组相比树突棘长度都明显增长(P<0.05)，不成熟树突棘比例显著增加(P<0.05)。除新生鼠2周的空白对照组(KOc2w)外，其它KOc组较同龄WTc组树突棘密度显著增加(P<0.01)。 2．MPEP对成年和幼年KO小鼠树突棘发育的影响 2．1 MPEP对KO小鼠树突棘长度的影响对于新生KO小鼠，MPEP 1天干预不改变树突棘的长度(P>0.05)；MPEP连续干预1周树突棘长度较空白对照组明显缩短(P<0.01)，但与野生对照组仍有差异(P<0.05)；连续干预2周较空白对照组显著缩短(P<0.01)，与野生对照组无明显差别(P>0.05)。对于成年KO小鼠，MPEP连续干预1周、2周树突棘长度均无改变(P>0.05)。 2．2 MPEP对KO小鼠树突棘密度的影响对于新生KO小鼠，MPEP 1天干预不影响树突棘密度(P>0.05)，MPEP干预1周可使树突棘密度较空白对照组显著降低(P<0.05)，与野生对照无明显差别(P>0.05)；MPEP干预2周对树突棘密度无影响(P>0.05)。对于成年KO小鼠，MPEP干预1周不影响树突棘的密度(P>0.05)，干预2周可使树突棘密度明显降低(P<0.05)。 2．3 MPEP对KO小鼠树突棘形态的影响给予新生KO小鼠MPEP干预1周、2周均可使其不成熟树突棘比例明显减少(P<0.05)，成熟树突棘比例显著增加(P<0.05)；MPEP 1天干预不改变KO小鼠树突棘的形态(P>0.05)。对于成年KO小鼠，MPEP干预1周、2周对树突棘的形态影响不明显(P>0.05)。 3．MPEP对幼年KO小鼠脑内MAP1B表达的影响新生KO鼠1周和2周的空白对照组MAP1B的表达较同龄WTc小鼠显著增加(P<0.01)。MPEP干预1次可明显减少1周空白对照组MAP1B的表达(P<0.05)；给予新生KO小鼠MPEP干预1周、2周均可使MAP1B的表达有更明显的降低(P<0.01)，与野生对照已无明显差别(P>0.05)。小结： 1．幼年和成年的FMR1基因敲除小鼠均表现不成熟的树突棘增多，树突棘增长和密度增加，表明FMRP在树突棘发育过程中发挥重要作用，其表达缺失可导致树突棘发育异常。 2．MPEP干预1周和2周可明显逆转新生FMR1基因敲除小鼠树突棘长度及形态异常，干预1周FMR1基因敲除小鼠树突棘密度明显降低。这提示脆性X综合征树突棘发育异常与FMRP缺失导致mGluR5信号过度激活有关，这可能是mGluR5拮抗剂发挥治疗作用的基础。 3．FMR1 基因敲除小鼠MAP1B表达显著增加，MPEP干预可以明显降低FMR1基因敲除小鼠MAP1B表达，表明mGluR5可能通过调节MAP1B的表达影响树突棘发育。 4．MPEP对新生鼠的干预有效，而对成年FMR1基因敲除小鼠树突棘形态影响不明显，提示mGluR5信号过度活动主要影响幼年FMR1基因敲除小鼠树突棘发育。MPEP 1次干预不影响树突棘的形态，表明mGluR5信号影响树突棘发育需要较长时间。

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作者
范红星;
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作者单位

广州医科大学;

广州医学院;

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授予单位广州医科大学;广州医学院;
学科神经病学
授予学位硕士
导师姓名易咏红;
年度 2007
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类遗传性疾病;
关键词
脆性X综合征; 树突棘; 苯基乙炔嘧啶; 基因敲除; 智力低下; 遗传性性疾病; 动物模型;

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