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Ⅳ型分泌系统在高致病性2型猪链球菌引发链球菌中毒性休克综合征中作用的研究

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前 言

第一章 T4SS-like 系统缺失的基因敲除株的构建

第二章 T4SS-like 系统缺失对S. suis 05ZYH33表型和毒力的影响

第三章 T4SS-like 系统缺失对细菌刺激机体产生炎性因子能力的影响

第四章 T4SS-like 系统缺失对细菌刺激细胞产生炎性因子能力的影响

全文总结

致 谢

参考文献

文献综述一 细菌的IV 型分泌系统

文献综述二 2 型猪链球菌及其致病机制的研究进展

攻读博士学位期间发表的文章

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摘要

2 型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2, S. suis 2)是一种重要的人畜共患传染病病原体。S. suis 2 感染不仅可致猪急性脑膜炎、败血症、关节炎、心内膜炎及急性死亡，并且可通过呼吸道和伤口等传播途径，导致人的感染发病和死亡。以往，人感染S. suis 2 导致急性脑膜炎和败血症只有散发性的病例出现，然而，1998年和2005年我国江苏省和四川省分别暴发大规模S. suis 2 感染疫情，病人中出现高比例的、国内外罕见的链球菌中毒性休克综合征(streptococcAltoxic shock syndrome, STSS)，临床症状表现为高热、低休克、全身多器官衰竭，病程短而凶险，致死率高，引发严重的公共卫生事件。
　　 最早报道认为STSS 由侵袭性A 型链球菌(GAS)所致。而且，认为超抗原与STSS有关。目前，尽管在S. suis 2中发现了很多毒力因子，例如荚膜多糖(capsulepolysaccharide, CPS)，溶菌酶相关蛋白(muramidase-related protein, MRP)以及溶血素(suilysin)等，但是没有发现与STSS 相关的超抗原或其同源物，因此，高致病性S. suis2 毒力增强及引发STSS的机制还不清楚。
　　 为了对造成这两次突发感染事件的S. suis 2 流行菌株的高致病性进行深入研究，南京课题协作组对1998年江苏流行的强致病株98HAH12和2005年四川流行的强致病株05ZYH33(两株均分离自STSS 病人)进行了全基因组测序和功能注释。相比较Sanger 研究中心公布的标准株P1/7的全基因组序列，发现了一个89 kb大小的具有毒力岛 (pathogenicity island, PAI) 特征的核酸序列为两个强致病株所特有，我们将这个特异性的片段命名为89K PAI。进一步的生物信息学分析，发现89K PAI的5’端编码了一个Ⅳ型样分泌系统(Type IV-like secretion system，T4SS-like)。IV 型分泌系统介导基因水平转移，通过细菌间接合作用，传递抗性基因和毒力基因，有利于细菌进化；
　　 另一方面，IV 型分泌系统转运效应蛋白质分子到宿主细胞，参与细菌致病。此外，T4SS转运效应分子到宿主靶细胞，在激发宿主产生过度的免疫炎症应答中起决定性的作用。
　　 例如，百日咳杆菌通过T4SS 介导百日咳毒素分泌，引起细胞毒效应;幽门螺杆菌的T4SS 参与CagA 毒素的释放，诱导上皮细胞 IL-8分泌，引起胃炎症性变化;嗜肺军团菌的icm/dot 系统可向哺乳动物宿主输出一种毒素，防止吞噬溶酶体的融合，促进细菌在胞内存活增殖；布氏杆菌T4SS在激发宿主产生过度的免疫炎症应答过程中起到重要作用。徐建国等研究发现05年引发STSS的强致病性菌株刺激机体产生的炎性介质水平要远远高于仅引起脑膜炎的致病株，而炎症因子的过度释放和激活跟STSS有着非常紧密的联系，提示过度炎症应答可能是产生STSS的直接原因。因此，高致病性S. suis 2的89K PAI 编码的T4SS-like 系统很可能与该菌引发STSS的致病机制有关。为阐明T4SS-like 系统与S. suis 05ZYH33 强致病性的关系，本文针对T4SS-like 系统上两个关键基因(virD4-89K和virB4-89K)，分别构建它们的缺失株，对T4SS-like系统缺失前后细菌的致病性及刺激机体产生炎性因子能力等方面进行了深入细致的研究。其实验内容和结果主要包括以下几个方面：
　　 1.T4SS-like 系统基因敲除突变株的构建：以S. suis 05ZYH33基因组DNA为模板，PCR分别扩增VirD4-89K和VirB4-89K 编码基因的上下游片段；同时以pSET2 穿梭质粒DNA为模板，PCR 扩增壮观霉素抗性基因SpcR，在限制性内切酶和T4 连接酶的作用下，分别将它们依次克隆到pUC18 载体的多克隆位点上，形成靶基因敲除载体pUC::virD4-89K和pUC::virB4-89K。分别将敲除载体电转化至05ZYH33 感受态细菌，筛选具有壮观霉素抗性的S. suis 2菌落。通过PCR 初筛和多重PCR 复筛的方法获得具有壮观霉素抗性的virD4-89K和virB4-89K基因敲除突变株ΔvirD4-89K和ΔvirB4-89K。
　　 2.T4SS-like 系统缺失前后细菌致病性的差异：我们首先观察在相同的条件下，两株敲除株和野生株S. suis 05ZYH33的基本生物学性状有无差异。结果发现，T4SS-like缺失未明显影响细菌的生长曲线、溶血活性、结构形态等生物学特性。以BALB/c小鼠为模型，用同等剂量(108 CFU)的野生株05ZYH33、突变株ΔvirD4-89K、ΔvirB4-89K、和对照株P1/7通过腹腔注射分别攻击小鼠。结果发现，野生株攻毒组小鼠攻毒后出现S. suis 2 感染的典型特征，而突变株攻毒组小鼠没有明显症状。另外，攻毒后24h，野生株组动物全部死亡，而至实验截止时间点突变株攻毒组动物还保持约60％的存活率。
　　 结果表明T4SS-like 系统缺失导致细菌致病性大大降低。
　　 3.动物水平上检测T4SS-like 系统缺失对细菌刺激机体产生炎性因子能力的影响：用同等剂量(5×106 CFU)的野生株05ZYH33、突变株ΔvirD4-89K、ΔvirB4-89K、和对照株P1/7分别攻击BALB/c小鼠，20只/组。在攻毒后4、8、12、16h分别从各组取5只小鼠，摘眼球取血，同时每组随机挑选两只小鼠取其心、肝、肾等组织，做病理分析。用ELISA 试剂盒检测小鼠血清样本中各炎性因子值。结果发现，突变株攻毒组小鼠攻毒8h后体内TNF-α, IL-6和 IL-12p70水平远远低于野生株攻毒组动物。
　　 此外，在攻毒后12h的野生株组小鼠肝组织的中央静脉和汇管区中发现大量炎性细胞浸润，而突变株组动物的肝组织中基本看不到炎性细胞。总的来说，T4SS-like 系统缺失导致细菌刺激宿主产生炎性因子的能力大大降低。
　　 4.细胞水平上检测T4SS-like 系统缺失对细菌刺激机体产生炎性因子能力的影响：我们分别用野生株05ZYH33、ΔvirB4-89K、ΔvirD4-89K和对照株P1/7 刺激人外周血单核细胞，将培养后各个时间点收集的样本用相应ELISA 试剂盒检测人IL-6、人IL-12p70和人TNF-α水平。结果发现，T4SS-like 系统缺失的突变株(ΔvirB4-89K和ΔvirD4-89K)刺激人外周血单核细胞表达炎性因子的水平与野生株相比较无明显差异。
　　 我们进一步以人全血细胞为对象，ELISA 试剂盒检测不同S.suis 2菌株刺激全血细胞产生炎性因子水平。结果发现，与以人外周血单核细胞为模型得到的结果一样，T4SS-like 系统缺失的突变株(ΔvirB4-89K和ΔvirD4-89K)刺激人全血表达炎性因子的水平与野生株无明显差异。
　　 综上所述，本研究为了从实验上证实中国强致病株S. suis 2中89K毒力岛上的T4SS-like系统是否与其高致病性及引发STSS有关，以S. suis 05ZYH33为对象，通过基因敲除技术获得了T4SS-like系统缺失的两株突变株。动物实验结果显示，T4SS-like系统缺失导致高致病性S. suis 2的致病性大大减弱，此外，T4SS-like系统缺失后细菌刺激机体产生炎性因子的能力大大降低。结果表明89K PAI上的这个T4SS-like系统参与转运了某种未发现的能够刺激机体产生过度炎性应答进而产生大量炎性因子释放的效应分子。高致病性2型猪链球菌到底通过T4SS-like系统介导了哪个或哪些效应分子转运，以刺激机体产生过度炎性应答，从而导致STSS，将是我们接下来重点关注的问题。本文研究结果大大推进了高致病性S. suis 2引发STSS的机制的研究，并为其开辟了一个新的方向。

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