ECC菌斑生物膜中白色念珠菌的分离鉴定及生物膜形成能力的初步研究

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研究表明，与婴幼儿龋(early childhood caries，ECC)发生密切相关的微生物主要有变形链球菌、放线菌及乳杆菌等。近年来，白色念珠菌(Candida albicans，C.albicans)与ECC的相关性及其致龋能力等开始引起学者们关注。白色念珠菌的致龋性主要表现为产酸性、耐酸性、粘附性及溶解胶原能力。白色念珠菌可粘附于牙体硬组织表面形成生物膜，是其致龋的首要步骤，并在合适的条件下快速繁殖引起疾病。
　　目的：通过对ECC组及无龋组(caries-free，CF)菌斑生物膜中的白色念珠菌进行分离纯化及鉴定，分析白色念珠菌检出率与ECC发生的相关性，及与龋失补牙数(decayed-missed-filled teeth，dmft)分级的关联性；构建白色念珠菌体外牙菌斑生物膜模型，观察白色念珠菌生物膜的结构；比较白色念珠菌临床菌株的生物膜形成能力，探讨白色念珠菌在龋病发生过程中的作用。
　　方法：①选取广州市四所幼儿园363名儿童作为研究对象，年龄范围为3-5岁，分为ECC组(n=238)和CF组(n=125)。采集ECC组口腔中龋坏牙体组织及CF组口腔中的龈上菌斑，应用科玛嘉念珠菌显色培养基(CHROMagar Candida)对临床菌株进行培养鉴定，并采用革兰氏染色、芽管试验及厚膜孢子形成试验进行鉴定，获得纯化的白色念珠菌株。②应用Pearson x2检验分析白色念珠菌检出率与ECC发生及dmft分级的关联性。③采用紫外分光光度计测定白色念珠菌生长光密度(Optical Density，OD)值，描绘生长曲线，了解其生长规律，为构建菌斑生物膜模型奠定基础。④构建白色念珠菌牙菌斑生物膜模型，应用扫描电子显微镜(scanning electron microscope，SEM)和荧光显微镜观察生物膜的结构。⑤通过采用平板菌落计数法定量检测生物膜活细胞数目，对比分析ECC组与CF组临床菌株的生物膜形成能力。
　　结果：①白色念珠菌的检出率在ECC组中为44.12％，CF组为19.2％，差异有统计学意义(P＜0.05)。ECC组中，男、女生白色念珠菌的检出率分别为59.69％、34.86％，两组间差异具有统计学意义(P＜0.05)。CF组中，白色念珠菌检出率男生为21.13％，女生为18.52％，两组间差异无统计学意义(P＞0.05)。②采用Pearsonx2检验进行关联分析，结果显示白色念珠菌检出率与dmft的分级具有关联性(P＜0.05)，其关联系数为0.353。③白色念珠菌起始OD值约0.2时，对数生长期在14～30h之间，其生长曲线具有迟缓期、对数期及稳定期。④采用ECC、CF组中的临床菌株及SC5314构建白色念珠菌牙菌斑生物膜模型。应用SEM观察与牙体组织共培养90min的菌株SC5314，发现其可粘附于牙片，并主要由孢子相细胞组成，细胞呈圆形或者椭圆形，直径约2～4μm，但未见菌丝的形成及其侵入牙本质小管。荧光显微镜观察临床菌株及SC5314在牙釉质、牙本质上形成菌斑生物膜的过程：培养4h的生物膜由孢子相细胞组成，多为散在的单个细胞，偶见微菌落；培养24h的生物膜细胞聚集形成微菌落，少见单个细胞；培养48h的生物膜显示红色死亡细胞数量增加。临床菌株在牙釉质及牙本质上形成的菌斑生物膜均未见菌丝形成。菌株SC5314在牙本质上形成的菌斑生物膜可见菌丝形成，而在牙釉质上形成的菌斑生物膜则未见菌丝形成。⑤采用方差分析生物膜平板菌落计数值，结果显示SC5314在不同时间点及不同附着载体上的生物膜形成能力不同。白色念珠菌接种于牙釉质上培养4h、24h及48h的生物膜形成能力不同，且差异具有统计学意义(P＜0.05)，白色念珠菌接种于牙釉质上培养24h的生物膜形成能力高于48h(P＜0.05)。白色念珠菌接种于牙本质上培养4h、24h及48h的生物膜形成能力不同，且差异具有统计学意义(P＜0.05)，白色念珠菌接种于牙本质上培养24h的生物膜形成能力高于48h(P＜0.05)。白色念珠菌接种于牙本质上培养24h的生物膜形成能力高于牙釉质，且差异具有统计学意义(P＜0.05)。⑥采用平板菌落计数法定量检测ECC及CF组中白色念珠菌临床菌株生物膜活细胞的数目，t检验分析结果显示，两组间差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　结论：⑴白色念珠菌检出率与ECC的发生密切相关。白色念珠菌的检出率与dmft的分级具有关联性。⑶白色念珠菌培养24h后，可在牙片上形成成熟的典型生物膜结构。⑷ECC与CF组白色念珠菌临床菌株的生物膜形成能力无明显差别。

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作者
林艳;
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作者单位

中山大学;

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授予单位中山大学;
学科口腔临床医学
授予学位硕士
导师姓名赵玮;
年度 2010
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类病原微生物分类与鉴定;
关键词
婴幼儿龋; 菌斑生物膜; 菌株鉴定; 白色念珠菌;

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