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淋病奈瑟菌主要外膜蛋白PⅠA真核表达载体的构建及免疫作用研究

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前言

第一部分 淋病奈瑟菌主要外膜蛋白真核表达载体pCI-PIA的构建、鉴定和体内表达

第二部分 淋病奈瑟菌DNA疫苗pCI-PIA免疫效果的观察

综述 DNA疫苗的研究进展

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攻读学位期间撰写的学术论文

致谢

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摘要

淋病(gonorrhea)是由淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhoeae，简称淋病奈瑟菌)引起的经典性病之一。人类是淋病奈瑟菌唯一的自然宿主，主要通过性接触而传播。感染淋病奈瑟菌之后，患者发生泌尿生殖系统的损害，表现为尿道炎和宫颈炎，以及附睾炎、盆腔炎等并发症，女性患者还可由于并发症造成不育、宫外孕等严重后果。淋病常见，在世界范围内广为流行；据近年来世界卫生组织估计，全世界每年约有6200万新病例发生，其中以欧美和非洲一些国家尤甚。发病与病人因素，诸如年龄、性别、种族、受教育程度、性行为方式及免疫力有关，并随地区和季节的不同会有所变化。在美国，淋病发病率在男性中最高，而在妇女中带菌最高。美国通过实施淋病控制计划，已使淋病处于30年来最低水平，远低于非淋菌性尿道炎的发病率。我国解放前淋病流行十分严重，解放初期淋病占第三位。到二十世纪六十年代中期，淋病基本被消灭。八十年代淋病又重新传入我国，据16个城市监测，1987年淋病患者为11，115例，1997年发生淋病224，331例，1999年340，960例，年增长率超过30％，淋病发病率为20.63/10万，居性病之首。2000年之后开始下降，淋病患者为285661人，2001年为234，561人，居第二位。 淋病奈瑟菌主要侵犯粘膜，尤其对单层柱状上皮和移行上皮细胞有很强的亲和力，淋病奈瑟菌侵入前尿道或子宫颈后，借助菌毛、外膜蛋白粘附到柱状上皮细胞表面进行繁殖，之后被柱状上皮细胞吞饮，进入细胞内大量繁殖，导致细胞损伤裂解。淋病奈瑟菌在逸入粘膜下层，通过内毒素与补体、IgM等协同作用，诱导中性粒细胞聚集吞噬，引起局部急性炎症，出现充血、水肿、粘膜糜烂和尿痛，形成典型尿道脓性分泌物。当细菌进入尿道腺体和隐窝后，腺管开口及隐窝被阻塞，潜藏的细菌可引起慢性淋病。近年研究发现，淋病奈瑟菌外膜蛋白在致病过程及宿主免疫反应中起着重要作用，其外膜蛋白至少有3种，分别称为外膜蛋白Ⅰ(PⅠ)、外膜蛋白Ⅱ(PⅡ)、和外膜蛋白Ⅲ(PⅢ)，其中PⅠ占外膜蛋白的60％以上，在细胞膜上形成孔道，又称孔洞蛋白Porin(Por)。淋病奈瑟菌血清学分型主要有PⅠA和PⅠB，可使水溶性物质、对细菌代谢有重要作用的物质及某些抗生素通过细胞膜进入细胞内。PⅠ作为外膜中的主要成分，因其相对保守的基因序列及相对稳定的表达而受到越来越多的重视，已经证实纯化的PⅠ在真核细胞浆膜脂质双分子层中形成电压依赖式离子选择通道，这与淋病奈瑟菌的致病密切相关。PⅠA的粘附功能需要孔洞处于一个开放状态，从而提供电压依赖受体结合部位和/或有效的嵌入宿主上皮细胞表面发挥离子通道的功能。淋病奈瑟菌外膜中大部分的PⅠ以三聚体形式与PⅢ形成复合物。PⅢ暴露的表面随着PⅠ表型的变化而变化，因此可以怀疑在PⅠ介导的粘附过程中是否是PⅢ起了实际作用，vanPutten等利用基因敲除(knockout)方法证实，在无PⅢ的情况下真正起粘附作用的仍然是PⅠA。淋病奈瑟菌的致病机制复杂，粘附是其致病的先决条件。淋病奈瑟菌入机体后首先需粘附于泌尿生殖道上皮细胞表面，然后才能进入机体引起一系列病变。以往只认为菌毛是该菌的粘附结构，但近年研究发现，外膜蛋白在致病菌粘附过程中也是至关重要。鉴于该菌的结构特点及致病特点，本研究选用淋病奈瑟菌PⅠA基因作为靶基因，构建淋病奈瑟菌真核表达载体(pCI-PⅠA)，观察pCI-PⅠA的PⅠA在小鼠肌细胞浆和膜上的表达，研究其在动物体内中所诱导的免疫反应，观察免疫产物体外抗菌效果。 本研究工作分以下二个部分： 一、淋病奈瑟菌真核表达载体pCI-PⅠA的构建、鉴定和体内表达 1、淋病奈瑟菌真核表达载体pCI-PⅠA的构建、鉴定 常规酚-氯仿法提取淋病奈瑟菌捷克标准株基因组DNA，根据淋病奈瑟菌外膜蛋白PⅠA基因序列设计一对携带限制性核酸内切酶(EcoRⅠ，SalⅠ)位点的引物，采用PCR方法获得PⅠA全基因片段，产物经酚：氯仿：异戊醇抽提后以乙醇沉淀纯化；纯化产物和载体质粒pCI-neo分别经EcoRⅠ，SalⅠ酶切后行凝胶电泳回收目的片段和质粒大片段，经T4连接酶连接；连接产物转化到感受态细胞中，经氨苄青霉素抗性、双酶切和测序筛选出阳性克隆，命名为pCI-PⅠA。 2、淋病奈瑟菌真核表达载体pCI-PⅠA体内表达 6只Balb/c小鼠分成3组，每组2只，分别注射pCI-PⅠA、空白质粒pCI-neo和生理盐水，100ug/35ul/只，初次免疫后10天同剂量行加强免疫一次。末次免疫4天后处死小鼠，取双侧股四头肌作石蜡切片。采用免疫组化方法检测pCI-PⅠA在小鼠骨骼肌细胞中的表达。结果发现，pCI-PⅠA在小鼠骨骼肌细胞膜和细胞浆中均获得PⅠA的表达，表明淋病奈瑟菌主要外膜蛋白(PⅠA)真核表达载体pCI-PⅠA在动物体内表达成功。 二、淋病奈瑟菌真核表达载体pCI-PⅠA接种、免疫效果的观察 1、pCI-PⅠA的接种 30只Balb/c小鼠随机分成3组，每组10只，分别注射pCI-PⅠA(100ug/35ul/只)、空白质粒pCI-neo(100ug/35ul/只)和生理盐水(35ul/只)，初次免疫后第3周和第6周各加强免疫一次。分别于第0周(免疫前)、第3、6、8、10、12、16、18周，自小鼠尾静脉取血，100ul/只，收集血清，第22周白眼眶取血收集血清。采用ELISA方法动态分析小鼠免疫前后血清特异性IgG抗体水平的变化，以及体外溶菌试验观察免疫血清杀菌效果。结果显示，血清特异性IgG抗体随着免疫时间的延长，效价逐渐升高，至第10周达到最高值(1：4000)，维持到第12周后开始逐渐下降，至第18周降低到最低水平。 2、抗PⅠA抗体体外杀菌效果的观察 取2张玻片，各滴加免疫血清和生理盐水，其中生理盐水为对照组，分别加入活的淋病奈瑟菌，数分钟后观察有无凝集，37℃15min孵育后，继续加入新鲜正常小鼠血清(含补体)，再孵育30min，反应体系倒入巧克力固体培养基上进行培养，24～48小时后观察结果。与阴性对照比较，菌落数减少25％即定为杀菌效力为“+”；菌落数减少25～50％即定为杀菌效力为“++”；菌落数减少50～75％即定为杀菌效力为“+++”；菌落数减少75～100％即定为杀菌效力为“++++”；菌落数减少50％以上为明显杀菌，即该血清对该淋病奈瑟菌临床株具有显著的杀菌作用。 3、T淋巴细胞增殖反应 18只Balb/c小鼠随机平均分成3组，分别注射pCI-PⅠA(100ug/35ul/只)、空白质粒pCI-neo(100ug/35ul/只)和生理盐水(35ul/只)，每周免疫1次，连续3周，末次免疫7天后，处死小鼠，取脾制备T淋巴细胞悬液，调整细胞浓度为2×106/ml，取100ul细胞悬液于96孔板中，实验孔加入10ug纯化PⅠA蛋白，对照孔不加PⅠA蛋白，温箱孵育72小时后，加入MTT，孵育4小时后加入二甲桠砜，测OD57o值，实验孔OD570值与对照孔OD570值差值代表淋巴细胞增殖能力。实验证实pCI-PⅠA免疫组小鼠淋巴细胞在体外受到PⅠA蛋白再次刺激后出现的明显的增殖，与空白质粒pCI-neo对照组相比有显著性差异(P＜0.01)，表明pCI-PⅠA能诱导机体T淋巴细胞的特异性反应。 结论：淋病奈瑟菌主要外膜蛋白抗原(PⅠA)的真核表达载体免疫保护作用在国内未见报导。本研究用分子生物学技术成功构建淋病奈瑟菌主要外膜蛋白PⅠA真核表达载体pCI-PⅠA；后者免疫Balb/c小鼠后能产生血清证实有特异性抗体，抗体在体外有一定杀菌作用；T淋巴细胞增殖实验证实pCI-PⅠA能诱导特异性的细胞免疫反应。由于目前蛋白疫苗制备纯化困难，成本较高，且需重复接种才能达到较好的免疫效果等问题的存在，本研究工作为防治淋病提供了一种新的候选疫苗。

著录项

  • 作者

    贺超;

  • 作者单位

    华中科技大学;

  • 授予单位 华中科技大学;
  • 学科 病原生物学
  • 授予学位 硕士
  • 导师姓名 廖芳;
  • 年度 2006
  • 页码
  • 总页数
  • 原文格式 PDF
  • 正文语种 中文
  • 中图分类 R378.16;
  • 关键词

    淋病; 奈瑟菌; 外膜蛋白; 真核表达; PⅠA;

  • 入库时间 2022-08-17 11:21:33

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