含重组菌毛蛋白的抗淋病奈瑟氏球茵或脑膜炎奈瑟氏球菌的疫苗

发明领域

本发明涉及在疫苗中采用重组菌毛蛋白来保护机体预防淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)或脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)引起的疾病。

发明背景

淋病奈瑟氏球菌(N.gonorrhoeae)和脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)是革兰氏阴性球菌。淋病奈瑟氏球菌和脑膜炎奈瑟氏球菌基因上非常相近，但在它们所致疾病的临床表现上差别很大。淋病奈瑟氏球菌造成淋病，而脑膜炎奈瑟氏球菌导致脑膜炎球菌性脑膜炎。这些奈瑟菌属的细菌存在于机体的粘膜表面。

Ⅳ型菌毛是许多革兰氏阴性细菌表面的非鞭毛性毛状结构，这些革兰氏阴性细菌包括：偶蹄形菌属(原来的类杆菌属)的节瘤偶蹄形菌，啮蚀艾肯菌，反硝化(脱氮)金氏菌，牛莫拉氏菌，腔隙莫拉氏菌，不液化莫拉氏菌，淋病奈瑟氏球菌，脑膜炎奈瑟氏球菌和铜绿假单胞菌(Bibliography Entries 1,2)。霍乱弧菌的毒素共调节菌毛和肠致病性大肠杆菌的束形成菌毛表现出与Ⅳ型菌毛有限数量的相似性，据认为是远亲关系(1,2)。对于淋球菌和脑膜炎球菌来说，有菌毛的细菌比无菌毛的细菌黏附于各种人上皮细胞的亲和力高得多，所以认为菌毛是使微生物锚着于粘膜感染部位的毒力因子。

Ⅳ型菌毛宽为5-7nM，长度为5μM。菌毛蛋白的亚基串联连接形成长而细的聚合体。对于致病奈瑟氏菌属，菌毛外观是天然的均聚物，由单一结构的亚基组成菌毛蛋白。菌毛蛋白的分子量为13,000-22,000道尔顿(1,2,3)。

菌毛蛋白天然装配到细菌外膜称为菌毛的螺旋结构中，该外膜的分子量约为10⁷道尔顿。当纯化的菌毛用pH12的磷酸缓冲液透析时，完整的菌毛不可逆的分解成菌毛蛋白凝聚物称为菌毛蛋白寡聚体(4)。这些菌毛寡聚体的凝聚物的大小(分子量约为600,000道尔顿)比完整的菌毛要小得多。

淋病奈瑟氏球菌表达的单一菌毛蛋白被最先由Schoolnik和其合作者分离出，并测序(5)。淋球菌菌毛蛋白由以下三个区域组成：(a)高度保护的氨基端区域(残基1-53)；(b)中间区域(残基54-124)该区显示有限量的序列变异和(c)蛋白的第三部分为羧基端(残基125-160)，含有高度可变的二硫环。

在天然感染过程中，菌毛经历高频率的时象和抗原性变异(3,6)。这种变异的遗传学特别复杂，已经进行了广泛的研究。每株淋球菌都有能力改变菌毛分子的一级氨基酸序列，从而改变其菌毛的抗原性质。负责这种变异的分子机理涉及：表达基因座(pilE)和众多(17到19)非启动子沉默(pilS)基因之间的非互换性重组(6)。菌毛序列(或其部分)从pilS基因座移动到一个表达基因座，产生新的菌毛变异，从而使淋球菌能够表达极其大量的菌毛蛋白。

与淋球菌相反，脑膜炎球菌只表达两种不同种类的菌毛，称为Ⅰ类和Ⅱ类菌毛。和淋球菌一样，脑膜炎球菌Ⅰ类菌毛经历抗原性和时象的变异(3)。Ⅰ类菌毛显示与淋球菌菌毛分子量(17-20kd)相似，和单克隆抗体(SM1)的反应性相似(该单抗与淋球菌菌毛上高度保护的表位结合)(3)。已克隆了许多Ⅰ类菌毛，显示氨基酸序列与淋球菌菌毛的序列有高度相似性(7)。相反，Ⅱ类菌毛不与SM1抗体反应，而且分子量也较低(13-16kd)。表达Ⅱ类菌毛的几个菌株显示能与抗淋球菌菌毛的多克隆抗血清起反应。Aho等人(7)最近确定了Ⅱ类菌毛的序列。奈瑟氏菌菌毛三个区域的第一个区域基本上是相同的。Ⅱ类菌毛蛋白与Ⅰ类菌毛和淋球菌菌毛的不同在于高变区有大缺失发生。Achtman等人(8)采用Ⅰ类或Ⅱ类菌毛的特异性单克隆抗体，证明了非洲的一些血清群A分离物与两种抗体都结合。已经证明了表达Ⅰ类菌毛的菌株也截除了沉默的Ⅰ类菌毛基因(7)。结合起来看，这些资料提示一个脑膜炎球菌单细胞同时表达两种菌毛蛋白的可能性。

由于认为是菌毛介导了与粘膜细胞的最初接触，所以值得感兴趣的是将这些结构作为疫苗抗原来预防菌毛细菌造成的疾病。在人群中进行了菌毛疫苗预防旅行者腹泻和淋病的试验(9)。然而，至今它们只对同源菌株有效。据报道一些以菌毛为基础的疫苗已用于家畜患的疾病，如牛传染性角结膜炎(红眼)(1)，羊脚腐烂症(1,10)和幼猪(9)或小牛(9)腹泻。在每种这类兽医研究的例子中，菌毛疫苗提供了免受表达同源而不是异源菌毛菌株攻击的保护。

最早的淋球菌疫苗包含整个微生物体，但提供很少或不提供保护作用。最近抗淋病疫苗的开发着重于纯化的表面组分，特别是菌毛(9,11)和孔蛋白(P.I或Por)(11)。然而至今，只有菌毛显示出能保护人体免受攻击，而且这限于保护人体抵御同源菌株(12)。已显示淋球菌菌毛的变性形式(4)能在小鼠和豚鼠中产生可在体外结合异源菌毛的抗体。然而，并不认为这是商业上可行的方法，因为在液体培养基(商业生产必需的)中带菌毛的淋球菌很难生长(1)。以初步人攻击研究的成功为基础，在一项大规模安慰剂对照双盲效力实验中进行了淋球菌菌毛疫苗的测试(12)。在该实验中，此疫苗不能保护男性志愿者避免淋球菌感染。推测该情况最可能的解释为菌毛的不均一性(12)。

确实淋球菌和脑膜炎球菌的菌毛蛋白的抗原性变异，是以菌毛为基础的疫苗开发中反复被列举的一个主要障碍(3,13,14,15,16,17)。已有人提出：装配的完整菌毛上的优势免疫表位是二硫环，该环呈现出最大的序列变异(17,18)。这就解释了用福尔马林处理的淋球菌菌株Pgh3-2的完整菌毛，在韩国现场实验失败的原因(12)。另外，本文包括的一些参考文献，其中谈及抗纯化的菌毛，或菌毛蛋白片段的抗血清，能结合于变性(Western印迹)或分离的奈瑟氏菌毛，但不与细菌表面的异源菌毛结合(16,17,19,20)。还没有完全弄清楚这是否是由于装配的菌毛中表位的抗原性变异或隐蔽所致。一些报道强调了这一点，这些报道证明只有在体外呈现出功能活性的单克隆抗体，才是那些不与异源菌毛结合的抗体(3)。牛莫拉氏菌和节瘤偶蹄形菌的完整菌毛显示菌毛引发保护性免疫应答是可能的(10)。然而这些疫苗只能保护机体抵抗表达同源菌毛而不是异源菌毛的细菌的攻击(10,21)。科学界一致认为看来以菌毛为基础的疫苗，如果可能，将只保护机体预防表达同源菌毛的细菌。

重组表达装配的菌毛在许多微生物体中都已描述，其依赖于适当的转运和装配基因(22)。对于奈瑟氏菌，在一个连续操纵子中没有发现编码参与菌毛装配和转运蛋白的基因，所以这种方法是不可行的。在欧洲专利202,260 B1中选择的另一种替代方法是在某种细菌宿主(该宿主已经具有装配不同Ⅳ菌毛所需的蛋白；如铜绿假单胞菌)中表达Ⅳ菌毛基因(23)。但如Hoyne等人所报道，在假单胞菌属外膜上表达和装配淋球菌菌毛是不稳定的(24)。当此种重组菌株在存在选择性抗菌素的液体培养基中生长时，野生型带菌毛的假单胞菌属会过度生长。作者陈述如下：

“宿主菌株中外源mePhe(N-甲基苯丙氨酸)菌毛蛋白产物的相容性

将依赖宿主和供体菌毛蛋白装配系统的趋异程度。观察到的表达淋球

菌菌毛蛋白的PAK/2PfS(铜绿假单胞菌K/2PfS株)的不稳定性…可

能表明mePhe菌毛种间表达受限在于该例子中所用的方法。”(24)由于该结果，在假单胞菌属中表达淋球菌菌毛不能认为是商业上可行的方法。

Elleman、Egerton和合作者描述了用节瘤偶蹄形菌的完整菌毛开发抵抗羊脚腐烂病的疫苗。现场实验显示完整的菌毛保护了动物预防了表达同源菌毛的节瘤偶蹄形菌感染。这意味着商品疫苗必需含有8或9种不同的菌毛，以实现全面保护。为了使该方法可行，克隆了节瘤偶蹄形菌的菌毛基因，并在大肠杆菌中表达(25)。发现重组菌毛蛋白与内膜结合。当在一次攻击试验中测试含有表达重组菌毛蛋白的大肠杆菌(超声处理过的)细胞疫苗时，重组大肠杆菌细胞产生的抗体滴度与纯化的天然菌毛的相似(25)。然而，重组大肠杆菌细胞疫苗产生的凝集滴度比完整菌毛的(690对.47,800)明显要低，并低于保护性相关的滴度(5,000-10,000)(25,26)。

在用节瘤偶蹄形菌作活性攻击后，与完整菌毛所显示的相反，重组菌毛蛋白疫苗不能显示出任何显著的保护活性。Emery和其合作者显示完整菌毛的变性废除了菌毛在动物中诱导保护的能力(27)。另外，用去污剂(辛烷基-β-D-葡萄糖苷)或低pH(2.2)解离的菌毛恢复了该蛋白的效力(引发保护避免攻击后严重病变的形成)(28)。而不管各组之间抗体滴度事实上没有显著区别。作者陈述说“可能有1个或多个与四级结构相关的表位(以被处理所破坏)”。他们进一步陈述说：

“大肠杆菌表达产物作疫苗失败，可能是由于其在宿主细胞膜上的物

理性吸留造成的，虽然初步实验表明这不是造成它无效的主要原因(没

有显示数据)。对于大肠杆菌表达产物作疫苗失败的另一种解释为：

表达的单元前菌毛蛋白单元可能由于前导序列的存在，不能结合到天

然构象中(以适当呈递重要的表位)。”(28)。

Elleman和其合作者证实在重组菌毛蛋白上存在构象表位的重要性，并证实它们需要通过抗原的更好呈递来增加免疫应答。他们建议两种方法：从大肠杆菌膜纯化该蛋白；或在铜绿假单胞菌中表达该蛋白，使其可装配到细胞表面的纤丝菌毛中。后一种方法是较佳的，因为“这将大大改善免疫原性并且简化蛋白的纯化”(25)。

另外，Elleman和其合作者也回顾了采用菌毛蛋白(菌毛的亚基蛋白)作为节瘤偶蹄形菌成熟纤丝菌毛完整的下等候选疫苗：

“成熟菌毛看来比同剂量的纤丝菌毛亚基蛋白可引起更强烈和适当

(即，K-凝集)的免疫反应。在血清学上约5,000的K-凝集滴度

一般认为是最小应答，该最小应答与抵抗某给定节瘤偶蹄形菌菌株感

染的足够保护性免疫力相当。这样应答的水平(达到更高的数量级)

容易通过接种成熟菌毛疫苗而实现，但接种分离的亚基蛋白〔只能引

发低水平的血清K-凝集抗体〕不能实现”(23)。

最近Alves等人报道了附加的数据，提示纤丝菌毛亚基蛋白不适合作候选疫苗(29)。当小鼠免疫接种了编码大肠杆菌CFA/I菌毛黏附素蛋白(如菌毛蛋白)的多核苷酸疫苗时，诱导产生的抗体与天然完整CFA/I菌毛诱导产生的不同。此外，这些抗重组蛋白的抗体与抗天然蛋白的抗血清相反，没有表现出任何凝集活性。

除了上述工作外，也开发了一种有效的以菌毛为基础的淋球菌或脑膜炎球菌疫苗。脑膜炎球菌疫苗限于那些具有血清型A、C、Y和W135荚膜的疫苗。

因此，需要鉴定用于保护机体抵抗由淋球菌或脑膜炎球菌所有血清型造成的疾病的疫苗中的组份。

发明概要

由此，本发明的一个目的是分别鉴定由淋球菌和脑膜炎球菌衍生的合适的抗原性结构，其可能组成抵抗这些细菌的可行性候选疫苗。这些候选疫苗必需能诱导、体识别并结合各致病性奈瑟氏菌的多种分离物的抗体。

下述本发明的这些和其它目的是通过克隆和表达淋球菌和脑膜炎球菌的重组菌毛蛋白(rpilin)而实现。

本发明还涉及一种质粒的构建，该质粒表达脑膜炎球菌嵌合的Ⅰ类菌毛蛋白，其中Ⅰ类脑膜炎球菌菌毛蛋白的氨基端区域被淋球菌菌毛蛋白相应的氨基端区域置换。该质粒表达的脑膜炎球菌嵌合性Ⅰ类重组菌毛蛋白的量显著高于全长脑膜炎球菌pilE基因表达的Ⅰ类脑膜炎球菌重组菌毛蛋白的量。

为了得到脑膜炎球菌嵌合的Ⅰ类重组菌毛蛋白的表达，将嵌合DNA序列首先插入到一个适当的质粒载体中。然后用该质粒转化或转染一个适当的宿主细胞。在本发明的一实施例中，宿主细胞是大肠杆菌菌株。然后在使宿主细胞表达所述嵌合的Ⅰ类重组菌毛蛋白的条件下，培育该宿主细胞。

本发明还涉及构建一种质粒，该质粒表达脑膜炎球菌嵌合的Ⅱ类菌毛蛋白，其中Ⅱ类脑膜炎球菌菌毛蛋白的羧基端区域被淋球菌菌毛蛋白相应的羧基端区域置换。

为了得到脑膜炎球菌嵌合的Ⅱ类重组菌毛蛋白的表达，将嵌合DNA序列首先插入到一个适当的质粒载体中。然后用该质粒转化或转染一个适当的宿主细胞。在本发明的一实施例中，宿主细胞是大肠杆菌菌株。然后在使宿主细胞表达所述嵌合的Ⅱ类重组菌毛蛋白的条件下，培育该宿主细胞。

在本发明的另一实施例中，将分离和纯化的重组菌毛蛋白(淋球菌、脑膜炎球菌或嵌合的)用于制备疫苗组合物，该组合物在哺乳动物宿主中能引发保护性免疫应答。此疫苗组合物可进一步包括佐剂、稀释剂或载体。佐剂的例子包括氢氧化铝、磷酸铝、MPL^TM、Srimulon^TM、QS-21、IL-12和霍乱毒素。将此疫苗组合物以足够的免疫原性量给予哺乳动物宿主，以保护宿主抵抗淋球菌或脑膜炎球菌造成的疾病。

附图简要说明

图1描绘了透射电子显微镜下淋球菌(菌株I756 recA-)的带菌毛细胞，与豚鼠抗淋球菌重组菌毛蛋白(从菌株Pgh3-1得到的)抗血清(1∶50稀释15分钟)培育后，与驴抗豚鼠IgG偶联的12nm胶体金(1∶5稀释，30分钟)反应，再用NanoVan染色。图1A为抗重组菌毛蛋白豚鼠免疫血清(第6周)；图1B为正常豚鼠血清(第0周)；图1C无第一抗体(primary antibody)。

图2描绘了豚鼠抗淋球菌重组菌毛蛋白(从菌株Pgh3-1得到的)抗血清，对带菌毛的淋球菌细胞(菌株I756 recA-)附着人子宫颈细胞(ME180细胞系)的作用。图2A描绘了豚鼠抗淋球菌重组菌毛蛋白抗血清对该附着的抑制(第6周)；图2B描绘了正常豚鼠抗血清不能防止带菌毛的淋球菌细胞附着子宫颈细胞(第0周)。圈出了每组实验中结合于子宫颈细胞的细菌的代表性丛集的大小。每组实验显示了同一实验条件下四个不同的视野。每组实验豚鼠抗血清作1∶10,000稀释。

图3描绘了透射电子显微镜下脑膜炎球菌(菌株H355)的带菌毛细胞，与豚鼠抗脑膜炎球菌嵌合的Ⅰ类重组菌毛蛋白(从菌株H44/76得到的)抗血清(1∶60稀释30分钟)培育后，与驴抗豚鼠IgG偶联于12nm胶体金(1∶5稀释，30分钟)反应，再用NanoVan染色。图3A为抗重组菌毛蛋白豚鼠免疫血清(第6周)；图3B为正常豚鼠血清(第0周)；图3C无第一抗体。细胞与抗血清培育前已固定。

发明详述

本发明涉及含有淋球菌或脑膜炎球菌重组菌毛蛋白的疫苗组合物。尽管上面讨论了许多，仍决定研究大肠杆菌中表达的这种重组菌毛蛋白的用途。令人惊讶的是，这些重组菌毛蛋白显示出候选疫苗的特征。

描述在大肠杆菌中克隆淋球菌pilE基因的第一个报道是1982年(30)。从此，对pilE的分子特征进行了大量的下述遗传因子的实验室研究，这些遗传因子控制着菌毛蛋白的表达、菌毛蛋白的转运、菌毛蛋白序列的变异和菌毛的宿主黏着特性。然而，没有一个报道描述了重组菌毛蛋白的纯化或重组表达菌毛蛋白的免疫应答。

下述的实施例2描述了编码淋球菌重组菌毛蛋白的pilE基因的克隆和表达。表达通过用含有pilE基因的质粒转化命名为TOP10F′的大肠杆菌菌株而实现。成功的克隆和表达后，通过pilE基因的测序证实与天然序列的相同性。为了有助于克隆，引入了NcoI2位点(要求修饰一个碱基)。结果，在七个氨基酸长信号肽中的第二氨基酸从天冬酰胺变为天冬氨酸。

实施例2中含pilE基因的质粒(命名为pPX2000)包含有一个氨苄青霉素抗性〔Amp^R〕标记。如实施例3中所述，构建了另一个含有卡那霉素抗性(Kan^R)标记，而不是Amp^R的质粒。该质粒命名为pPX2002，在其转化大肠杆菌TOP10F′菌株后，表达了淋球菌重组菌毛蛋白，水平类似于pPX2000(含有Amp^R标记)所得到的水平。

如实施例4所述，用相似的方案构建了命名为pPX2003含有脑膜炎球菌Ⅰ类菌毛基因的一个质粒。引入NcoI位点(CC ATG G)，跨越编码信号肽基因的起始端。这将信号肽第二氨基酸残基从天冬酰胺变为天冬氨酸(第一残基仍为甲硫氨酸)。还包括一个Amp^R标记。将该构建物转化大肠杆菌TOP10F’菌株后，表达了脑膜炎球菌Ⅰ类重组菌毛蛋白。然而，其表达的水平显著低于pPX2000或pPX2002得到的淋球菌重组菌毛蛋白。不受理论的束缚，这种较低的表达水平可能是由于大量的反向重复序列(出现于重组Ⅰ类pilE中)所致。

为了增加脑膜炎球菌菌毛蛋白的表达，如实施例5所述，构建了一个嵌合质粒。pPX2003中编码脑膜炎球菌Ⅰ类重组菌毛蛋白的前60个氨基酸用pPX2002中淋球菌DNA的相应区域置换。结果产生的Amp^R质粒命名为pPX2004，其具有的核苷酸序列见SEQ ID NO：1。用pPX2004质粒转化命名为TOP10F’的大肠杆菌K12菌株。诱导后，与pPX2003表达的脑膜炎球菌重组菌毛蛋白的量相比，表达的嵌合重组菌毛蛋白有了显著增加。该嵌合构建物的表达水平与pPX2002表达的淋球菌重组菌毛蛋白的量相当。嵌合的Ⅰ类重组菌毛蛋白长度167个氨基酸(包括信号序列)(SEQ ID NO：2)，与预计的大小相符。

命名为TOP10F’的大肠杆菌K12菌株(含有重组质粒pPX2004)，于1998年1月27日由申请人保藏在由美国典型培养物保藏中心，10801 UniversityBoulevard,Manassas,Virginia 20110-2209,U.S.A.,并已指定ATCC登录号为ATCC98637。

如实施例6所述，构建的嵌合质粒，其脑膜炎球菌Ⅱ类pilE基因的3’端被淋球菌的相应区域置换。具体说，pPX8001中编码二硫环(脑膜炎球菌菌株FAM18的脑膜炎球菌Ⅱ类菌毛蛋白的最后22个氨基酸)的DNA被pPX2000中淋球菌菌株Pgh3-1的淋球菌(pilE)DNA的相似(但更大)区域加上羧基端区域的附加部分(共计44个氨基酸)所置换。结果得到的Amp^R质粒命名为pPX8017，它具有的核苷酸序列见SEQ ID NO：3，其中核苷酸1-378来自脑膜炎球菌Ⅱ类，而核苷酸379-510来自淋球菌。用质粒pPX8017转化命名TOP10F’的大肠杆菌K12菌株。诱导后，表达了嵌合的Ⅱ类重组菌毛蛋白，其长度为170个氨基酸(包括7个氨基酸长的信号序列)(SEQ ID NO：4)，其中氨基酸1-126来自脑膜炎球菌Ⅱ类，而氨基酸127-170来自淋球菌。该嵌合的Ⅱ类重组菌毛蛋白与预计的大小相符。出于克隆考虑，将一个NcoI位点引入，故将信号序列中的第二个氨基酸从赖氨酸变为谷氨酸。预计这种变化不会对抗原性或免疫原性有任何影响。

携带重组质粒pPX8017的大肠杆菌K12菌株(称为TOP10F’)的样品，由本申请人在1999年4月15日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)(10801University Boulevard,Manassas,Virginia 20110-2209,U.S.A.),其ATCC登录号为ATCC 207199。

除了实施例2-6中详细描述的宿主细胞一载体系统之外，各种不同的宿主细胞一载体系统都适合用于表达本发明疫苗中所用的淋球菌、脑膜炎球菌和嵌合重组菌毛蛋白。载体系统应与所用的宿主细胞相容。适合的宿主细胞包括：用质粒DNA、粘粒DNA或嗜菌体DNA转化的细菌；病毒如牛痘病毒和腺病毒；酵母如Pichia细胞；昆虫细胞如Sf9或Sf21细胞；或哺乳动物细胞系如中国仓鼠卵巢细胞；以及其它常规生物体。

各种不同的常规转录和翻译元件可用于宿主细胞载体系统。将pilE DNA插入一个表达系统，并将启动子和其它控制元件连接到该载体的特定位点，这样当将该质粒载体插入到宿主细胞时，宿主细胞可以表达pilE DNA。

根据所用的宿主细胞载体系统，可通过转化、转导、转染或感染将质粒引入宿主细胞。然后，在宿主细胞可表达重组菌毛蛋白的条件下培育宿主细胞。

本发明还涉及一种分离和纯化的DNA序列，它包含的DNA序列编码脑膜炎球菌嵌合的Ⅰ类重组菌毛蛋白，该蛋白的氨基端区域来自淋球菌pilE基因而其中央和羧基端区域来自脑膜炎球菌pilE基因(SEQ ID NO：1)。SEQ ID NO：1中的核苷酸1-501编码加工前的脑膜炎球菌嵌合的Ⅰ类重组菌毛蛋白；核苷酸22-501编码加工后成为成熟蛋白的脑膜炎球菌嵌合的Ⅰ类重组菌毛蛋白。本发明还涉及脑膜炎球菌嵌合的Ⅰ类重组菌毛蛋白，该蛋白具有SEQ ID NO：2中氨基酸1-167的氨基酸序列(加工前)或SEQ ID NO：2中氨基酸8-167的氨基酸序列(加工后成为成熟蛋白)。由淋球菌重组菌毛蛋白或脑膜炎球菌嵌合的Ⅰ类重组菌毛蛋白构建物产生的总蛋白中约10％是缺少信号序列的，其已通过加工除去。

本发明还涉及一种分离和纯化的DNA序列，它包含的DNA序列编码脑膜炎球菌嵌合的Ⅱ类重组菌毛蛋白，该蛋白的羧基端区域来自淋球菌pilE基因而其中央和氨基端区域来自脑膜炎球菌pilE基因(SEQ ID NO：3)。SEQ ID NO：3中的核苷酸1-510编码脑膜炎球菌嵌合的Ⅱ类重组菌毛蛋白(加工前)；核苷酸22-510编码脑膜炎球菌嵌合的Ⅱ类重组菌毛蛋白(加工后成为成熟蛋白)。本发明另外还涉及脑膜炎球菌嵌合的Ⅱ类重组菌毛蛋白，该蛋白具有SEQ ID NO：4中氨基酸1-170的氨基酸序列(加工前)或SEQ ID NO：4中氨基酸8-170的氨基酸序列(加工后成为成熟蛋白)。

除了包含在pPX2004和pPX8017中的嵌合DNA序列(分别编码脑膜炎球菌嵌合的Ⅰ类重组菌毛蛋白和脑膜炎球菌嵌合的Ⅱ类重组菌毛蛋白)之外，本发明还包括(因为遗传密码的丰余性)在生物学上等价于编码嵌合重组菌毛蛋白的DNA序列，也就是说，这些其它的DNA序列的特征，其是核苷酸序列与本文所示的核苷酸序列虽然不同，但它们所编码的蛋白质的氨基酸序列与SEQID NO：1或SEQID NO：2中的DNA序列所编码的相同。

具体地说，本发明包括那些与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的序列有足够相同性，从而可以在高度严谨Southern杂交条件(例如Sambrook等人(31)中所述的条件)下能杂交的DNA序列。

本发明也包括这样的DNA序列：它编码的氨基酸序列不同于脑膜炎球菌嵌合的Ⅰ类或Ⅱ类的重组菌毛蛋白，但在生物学上等价于这些蛋白之一的氨基酸序列(SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4)。这些氨基酸序列可以说是与嵌合重组菌毛蛋白的那些序列在生物学上等价，如果它们序列的区别只是重组菌毛蛋白序列的微小缺失、插入或替代，从而使该序列的三级构象与重组菌毛蛋白的三级构象相比基本上没有变化。

例如，氨基酸丙氨酸(一种疏水性氨基酸)的密码子可用编码另一疏水性较差的残基(如甘氨酸)，或一个疏水性较强的残基(如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子替代。相似地，改变可以是导致一种带负电荷的残基替代另一个(如天冬氨酸替代谷氨酸)或一种带正电荷的残基替代另一个(如赖氨酸替代精氨酸)以及以亲水性近似的残基之间的替代，也可以期待产生生物学上相当的产物。期望导致蛋白分子N-端或C-端改变的核苷酸改变，但不会改变蛋白质的活性。

另外，在已知的可变区域中的变化是生物学上等价的，其中保守区的三级构象基本上没有改变(与那些重组菌毛蛋白的相比)。生物学上等价序列的另一种定义为：仍旧有能力产生交叉反应的免疫应答的序列。具体地说，脑膜炎球菌嵌合的Ⅰ类和Ⅱ重组菌毛蛋白可通过将淋球菌菌毛蛋白的相应插入物加长或缩短来修饰，只要修饰的嵌合重组菌毛蛋白仍具有产生交叉反应免疫应答的能力。

每个建议的修饰都是采用本领域的常规技术，如测定编码产物是否保留了结构和生物活性。所以，说明书或权利要求书中所用的术语“脑膜炎球菌嵌合的Ⅰ类重组菌毛蛋白”或“脑膜炎球菌嵌合的Ⅱ类重组菌毛蛋白”，可以理解此术语包含了导致产生生物学上等价蛋白的所有这些修饰和变异。

如实施例7所述，淋球菌重组菌毛蛋白与表达该蛋白的大肠杆菌的细胞膜结合。多种去污剂能够选择性溶解大肠杆菌的重组菌毛蛋白，包括Empigen^TM BB、Triton^TM X-100、还原的Triton^TM X-100、辛烷基-β-D-吡喃葡萄糖苷(OG)、Zwittergent^TM 3-10或3-14。离心后，透析和用柱分级分离，得到纯化的重组菌毛蛋白。

如实施例8所述，嵌合的Ⅰ类重组菌毛蛋白通过破裂大肠杆菌细胞分离和纯化，通过离心澄清，过滤，并在两根柱上分级分离。

如实施例9所述，脑膜炎球菌嵌合的Ⅱ类重组菌毛蛋白可通过破裂大肠杆菌细胞来分离和纯化，通过离心澄清，透析，并在两根柱上分级分离。

如实施例10所述，对纯化的淋球菌重组菌毛蛋白进行重复的N-端测序。20-40个氨基端残基的测序给出的结果与DNA序列推导出的氨基酸序列一致。质谱法测得重组菌毛蛋白(有信号序列)的分子量为18,006道尔顿，很符合预计的质量17,981道尔顿(根据氨基酸成分预计)。相反，当重组菌毛蛋白用去污剂进行大小排阻柱层析时，得到的表观分子量为68,899道尔顿。这提示重组菌毛蛋白已凝集。用PBS透析重组菌毛蛋白，来去除去污剂，结果所得物质的表观分子量为452,349道尔顿(用凝胶过滤测定)。这提示其经历了进一步的凝集。

如实施例11所述，用纯化的淋球菌重组菌毛蛋白免疫豚鼠或小鼠获得免疫血清。如实施例12中列出的，Western印迹分析显示抗重组菌毛蛋白的抗血清结合于带菌毛的淋球菌细胞制的全细胞裂解物，而不与无菌毛的细胞裂解物结合。相反，抗菌毛蛋白寡聚体的抗血清结合于带菌毛的和无菌毛的细胞裂解物。

如实施例13详细描述的，用ELISA分析时，该混合的抗淋球菌重组菌毛蛋白的抗血清对结合于纯化的淋球菌重组菌毛蛋白具有很高的终点滴度。实施例13也详细描述了各种佐剂的作用。当重组菌毛蛋白单用MPL^TM、MPL^TM与磷酸铝、或Stimulon^TM QS-21作佐剂时，在小鼠内得到很好的体液免疫应答。

如实施例14中列出的，全细胞ELISA显示，抗重组菌毛蛋白的抗血清结合于特定淋球菌菌株有菌毛的细胞，但不结合于同基因特定淋球菌菌株无菌毛的细胞。

如实施例15所述，用淋球菌重组菌毛蛋白(有或无天然霍乱毒素)对小鼠进行鼻内免疫接种。小鼠用无佐剂的重组菌毛蛋白免疫接种后，产生的混合血清的抗原ELISA测得有显著的免疫应答；这种应答由于加入天然霍乱毒素而增加。混合血清对结合完整有菌毛的淋球菌细胞ELISA滴度很低；当小鼠用天然霍乱毒素免疫接种时，这种结合大大提高。

如实施例16所述，免疫电镜显示抗重组菌毛蛋白的抗体沿着淋球菌表面的菌毛纤丝长度(方向)结合。这提示体内抗体结合于细菌表面存在的表位。

实施例17显示，与重组菌毛寡聚物抗血清所得的结果相比，与异源带菌毛细菌分离物结合的重组菌毛蛋白抗血清滴度较高。用pH12磷酸缓冲液透析重组菌毛蛋白，使重组菌毛蛋白转变成重组菌毛蛋白寡聚物。

菌毛介导了淋球菌与人粘膜细胞的初步结合。所以，如果一种抗原有能力引发阻止淋球菌吸附于人粘膜细胞的抗体，就证明了该抗原是候选疫苗。

如实施例18中所述，豚鼠抗重组菌毛蛋白抗血清显著地抑制了表达异源菌毛的淋球菌与人子宫颈上皮细胞的结合。故淋球菌菌毛的生成与该细菌的感染性相关(2,3,32)。

这些数据表明，重组菌毛蛋白能够产生结合于完整淋球菌细胞上各种菌毛的抗体，而且这种抗血清表现出功能活性(抑制细菌黏附)，这将保护免疫接种的人抵抗淋球菌定居和感染(32,33)。前面已经报道过，用表达节瘤偶蹄形菌的重组菌毛蛋白的大肠杆菌细胞免疫接种是有免疫原性的(23,25,28)，但不能保护机体抵抗攻击。因为这些结果，这些研究者不再采用重组菌毛蛋白亚基，而赞成采用装配的菌毛。然而，本文描述的数据提示，重组表达的菌毛蛋白纯化后诱导了一种保护人体防止淋球菌定居的免疫应答。所以，这些数据支持了重组菌毛蛋白是用于抵抗淋球菌的候选疫苗的观点。

如实施例19所述，对脑膜炎球菌嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白的N端测序。该35个氨基端残基的测序给出的结果与DNA序列推导的氨基酸序列相一致。嵌合重组菌毛蛋白(有信号肽)的分子量通过质谱测定为17,659道尔顿，与根据氨基酸成分预测的17,676道尔顿相当。相反，当脑膜炎球菌嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白用去污剂进行大小排阻层析分析时，得到表观分子量为69,480道尔顿。与淋球菌重组菌毛蛋白相比，这提示脑膜炎球菌嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白凝集了。

如实施例20详细描述的，当用ELISA分析时，抗脑膜炎球菌嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白的混合的抗血清，对脑膜炎球菌Ⅰ类重组菌毛蛋白和带菌毛的脑膜炎球菌细胞都有很高的终点滴度。如实施例20中详尽所述的，佐剂，特别是Stimulon^TMQS-21，对抗脑膜炎球菌嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白的抗血清结合于脑膜炎球菌嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白和带菌毛的脑膜炎球菌细胞，产生了显著的应答。

如实施例21所述，免疫电镜显示抗脑膜炎球菌嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白的抗体沿着脑膜炎球菌菌毛的长度(方向)结合。这提示体内抗体结合于细菌表面存在的表位。

在实施例4中，显示抗淋球菌重组菌毛蛋白的抗血清识别并结合于带菌毛的脑膜炎球菌细胞。在实施例22中已表明，产生的抗脑膜炎球菌嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白的抗血清可结合于带菌毛的淋球菌细胞。

如实施例23所述，用豚鼠抗脑膜炎球菌嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白抗血清被动免疫接种幼鼠，能够帮助体内预防脑膜炎球菌血症。在接受这种免疫血清的动物中细菌的定居水平显著降低。另外，用重组表达的菌毛蛋白产生的免疫应答能够在体内保护抵抗表达异源菌毛蛋白的脑膜炎球菌。

如实施例24所述，用带有或不带霍乱毒素的脑膜炎球菌嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白鼻内免疫接种小鼠，其中的霍乱毒素是突变体(其氨基酸位点29的谷氨酸用组氨酸置换)(CT-CRM,E29H)。小鼠用无佐剂的重组菌毛蛋白接种后，产生的混合血清在抗原ELISA中测得有明显的免疫应答；该应答通过加入突变体CT-CRM,E29H霍乱毒素而提高。

如实施例25所述，小鼠皮下免疫接种含MPL^TM佐剂的脑膜炎球菌嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白后显示：抑制了脑膜炎奈瑟氏球菌Ⅰ类菌株在小鼠鼻咽的定居。

如实施例26所述，Western印迹分析显示从用脑膜炎球菌嵌合Ⅱ类重组菌毛蛋白免疫接种的豚鼠得到的抗血清，结合于带菌毛的脑膜炎球菌细胞(表达Ⅰ类或Ⅱ类菌毛蛋白)的全细胞裂解物。

如实施例27所述，诱导的针对部分纯化的脑膜炎球菌嵌合Ⅱ类重组菌毛蛋白的抗血清结合于同源细菌菌株的脑膜炎球菌细胞。

综上所述，这些资料支持了重组菌毛蛋白，特别是脑膜炎球菌嵌合Ⅰ类和Ⅱ类重组菌毛蛋白，是抗脑膜炎奈瑟氏球菌的候选疫苗的观点。

淋球菌重组菌毛蛋白可用于制备保护哺乳动物抵抗淋球菌造成的疾病的疫苗。脑膜炎球菌嵌合重组菌毛蛋白，脑膜炎球菌嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白和脑膜炎球菌嵌合Ⅱ类重组菌毛蛋白可用于制备保护哺乳动物抵抗脑膜炎奈瑟氏球菌造成的疾病的疫苗。

另外，交互保护抵抗不同奈瑟氏球菌菌种，可通过用含有淋球菌重组菌毛蛋白(保护哺乳动物抵抗由脑膜炎奈瑟氏球菌造成的疾病)的疫苗进行免疫接种；或用含有脑膜炎球菌重组菌毛蛋白，脑膜炎球菌嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白或脑膜炎球菌嵌合Ⅱ类重组菌毛蛋白的疫苗进行免疫接种保护哺乳动物抵抗由淋球菌造成的疾病。

这些疫苗组合物包括一种分离和纯化的重组菌毛蛋白，该疫苗组合物在哺乳动物宿主内能引发保护性免疫应答。

含有重组菌毛蛋白的疫苗可以混有免疫学上可接受的稀释剂或常规形式的载体，来制备可注射的溶液或悬浮液。该疫苗引发的抗体水平可以通过采用某些佐剂来改善，如Stimulon^TM QS-21(Aquila Biopharmaceuticals,Inc.,Framingham,MA)、MPL^TM(3-O-脱酰单磷酸脂A;RIBI ImmunoChem Research,Inc.,Hamiltion,MT)、磷酸铝、氢氧化铝、IL-12(Genetics Institute,Cambridge,MA)和霍乱毒素(野生型或突变形式，如氨基酸29位点的谷氨酸被另一个氨基酸，较佳的是组氨酸置换，美国临时专利申请60/102,430)。

本发明的疫苗可通过传统形式的注射，如皮下、腹腔内或肌内注射入人体，以及口腔、粘膜、鼻内或阴道给予，以诱导保护机体抵抗淋球菌或脑膜炎球菌造成的疾病的主动性免疫应答。给予的剂量由本领域技术人员已知的方法确定。通过单次剂量的疫苗，或需要给予几次加强剂量来赋予保护力。

为了使本发明更加易于理解，列出以下实施例。这些实施例仅是出于说明的目的，不构成对本发明范围的任何限制。

实施例

按Sambrook等人所述的方案，使用了标准分子生物学技术(31)。

实施例1

细菌和细胞培养

细菌和培养条件

淋球菌分离物得自Tampa,FL;Ottawa,Canada;Washington,D.C.;Seattle,WA;Rochester,NY;Chapel Hill,NC;和Evanston,IL。脑膜炎球菌分离物得自Chapel Hill,NC;和Bilthoven,Netherlands。

细菌以冻干形式保存或-70℃冷冻直到使用。当在固体培养基上生长时，琼脂平板在潮湿环境和5％(v/v)CO₂的37℃培养箱中培育。淋球菌和脑膜炎奈瑟氏球菌在GC培养基(Difco Laboratories,Detroit,MI)上生长，该培养基无血红蛋白，但添加有葡萄糖(400mg/L)、谷氨酰胺(10mg/L)、羧化辅酶(20μg/L)和硝酸铁(500μg/L)。脑膜炎球菌的液体悬浮培养物在缺少琼脂的同样培养基中，37℃振荡培养箱(70RPM)中生长。在培养分离自小鼠鼻组织匀浆的脑膜炎球菌实验中，细菌在上述GC培养基上生长，且含有下列混合的抗菌素(Difco)：硫酸粘菌素(75μg/ml)、利霉菌素(125μg/ml)、万古霉素(30μg/ml)和乳酸三甲氧苄二氨嘧啶(125μg/ml)。通过菌落形态鉴定带菌毛的淋球菌，单菌落每天传代以保持表型。脑膜炎球菌细胞菌毛生成状态通过对NanoVan染色(Nanoprobes,Stony Brook,NY)(pH8 30分钟)的样品进行透射电子显微镜评估。使大肠杆菌在SOB琼脂上生长，SOB琼脂由以下组成：20g/L Bacto胰蛋白胨(Difco)、5g/L酵母提取物(Difco)、0.6g/L NaCl、0.2g/L KCl和l％(w/v)琼脂(pH 7.5)，或在SOB肉汤(不加琼脂)中生长。在一些实验中，Bacto胰蛋白胨用相同量的Hysoy^TM(Sheffield Products,Norwich,NY)替换。

上皮细胞培养

ME-180细胞系(ATCC,Beltsville,MD)是一种表皮样癌，起初衍生于子宫颈癌。使该细胞在补加10％(v/v)胎牛血清(Sigma,St.Louis,MO)、青霉素G(1000单位/mL)(Gibco BRL)、L-链霉素(1mg/mL)(Gibco BRL)和2mM L-谷氨酰胺的RPMI1640(Gibco BRL,Gaithersburg,MD)中，37℃5％(v/v)CO₂的潮湿环境下生长。细胞每3-4天分裂一次。

实施例2

淋球菌在大肠杆菌内的克隆和表达

用带菌毛的淋球菌菌株Pgh-1冷冻样品作为PCR反应中pilE DNA的来源。pilE基因的扩增使用了以下识别完整菌毛蛋白(包括前导序列)3’和5’端的引物：5’CCC CGC GCC ATG GAT ACC CTT CAA AAA GGC 3′(PILEFWD)(SEQ IDNO：5)和5’GGG CCT GGA TCC GTG GGA AAT CAC TTA CCG 3’(PILEREV)(SEQ ID NO：6)。得到的PCR产物在pilE编码区域的起始处含有一个NcoI位点，在末端含有一个BamHI位点。考虑到克隆，将NcoI位点引入该基因。这将导致信号序列的第二个氨基酸的改变，从天冬酰胺(AAT)变成天冬氨酸(GAT)。由于氨基酸2是信号肽的一部分，该信号肽在成熟蛋白的正常加工中被劈开，所以这种改变预期对抗原性或免疫原性不会有任何影响。将PCR产物克隆到pCR^TMⅡTA克隆载体(Invitrogen,Carlsbad,CA)中，连接，转化入大肠杆菌TOP10F’中(Invitrogen)。在含有100μg/mL氨苄青霉素的平板或含有50μg/mL卡那霉素的平板上筛选菌落。从这些转化体的过夜培养物中分离出质粒DNA，并用酶EcoRI和NotI限制性消化进行分析。

对四个含有正确大小插入片段的克隆作DNA序列分析，来确证pilE PCR DNA片段的存在。克隆#17，命名为pPX1999，用作pilE基因的来源。pPX1999和pTrcHisA(Invitrogen)的质粒DNA用NcoI和BamHI限制性内切酶消化，将该DNA片段凝胶分离，连接并转化入大肠杆菌TOP 10F’中。筛选氨苄青霉素抗性菌落，分离新转化体的质粒DNA，用BamHI和NcoI限制性内切酶进行DNA限制酶切分析。对两个具有正确限制模式的克隆作DNA序列分析。这两个克隆都具有正确的DNA序列，命名为pPX2000。

为了测试重组菌毛蛋白的表达，使含有这些克隆的培养物在加有100μg/mL氨苄青霉素和12μg/mL四环素的SOB摇瓶或发酵罐中生长。当用摇瓶时，大肠杆菌在1L培养基中生长至A₆₀₀=0.9-1.0。加入终浓度为1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组菌毛蛋白的表达，使生长持续1-4小时，此时离心(13,689×g,20分钟,4℃)收集细胞，-20℃保存。对于发酵罐来说，将一个平板的过夜培养物接种到含有500mL培养基的摇瓶中，继续培养过夜。然后将该液体培养物接种到含有8.9L培养基的Biostat B发酵罐(Braun Biotech,Allentown,PA)中。当含有HySoy^TM的培养基添加了终浓度1％(w/v)的葡萄糖时，发酵罐中细菌的生长得到提高。当培养物达到A₆₀₀=1.0时，加入终浓度为1mM的IPTG，使继续生长1-4小时，然后离心(13,689×g,20分钟,4℃)收获细胞。丢弃培养液，-20℃细胞沉淀保存。用IPTG诱导后，显著增加了重组菌毛蛋白的表达，在诱导后3-4小时达到最高水平。

诱导培养物的样品用十二烷基磺酸钠(SDS-PAGE)进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。重组菌毛蛋白用考马斯蓝染色观察，用淋球菌菌毛特异性单克隆抗体(克隆#A33020023,Biospacific,Emeryville,CA)进行Western印迹验证鉴定它。

实施例3

构建含有卡那霉素抗性标记的淋球菌重组pilE质粒

构建一个质粒，其Amp^R标记用Kan^R标记置换。除下面特别指出的外，用实施例2中的流程。对pTrcHisA质粒DNA进行PCR反应，采用TrcFXba引物，5’GGC TCT AGA CTG TCA GAC CAA GTT TAC TC 3’(SEQ ID NO：7)，和TrcRXba引物，5’GGC TCT AGA TTG AAG CAT TTA TCA GGG 3’(SEQID NO：8)。带下划线的序列编码XbaI限制位点。约3.5kb PCR产物含有pTrcHisA DNA减去氨苄青霉素编码区域。对pACYC177质粒DNA(New England Biolabs,Beverly,MA)进行了另一个PCR反应，采用KanFXba引物，5’GGC TCT AGA TAA ACAGTA ATA CAA GGG G3’(SEQ ID NO：9)，和KanRXba引物，5’GGC TCTAGA TTA GAA AAA CTC ATC GAG C3’(SEQ ID NO：10)。同样，带下划线的序列编码XbaI限制位点。约860bp的PCR产物含有卡那霉素抗性基因。两种PCR产物从琼脂糖凝胶上纯化得到，用XbaI限制性内切酶消化二种DNA，提取并连接起来。将一份连接反应物转化到大肠杆菌TOPl0F’中，一份转化混合物接种含有30μg/mL卡那霉素的SOB平板。

将总计48个Ka^R菌落在含有氨苄青霉素或卡那霉素的SOB平板上划线培养(一式两份)。如预计的那样，所有Kan^R菌落都是氨苄青霉素敏感的。由于克隆设计是对称的，分离获得了两种取向的卡那霉素插入物。筛选出与原先氨苄青霉素基因相同顺时针方向的卡那霉素插入物，用于进一步研究，称其为pZ564。将pZ564中含有lacIq基因、trc启动子和多克隆位点的DNA区域，用pPX2000质粒的相似区域(也含有pilE)置换，方法如下：用SphI和XmnI限制性内切酶消化pZ564和pPX2000。凝胶纯化pPX2000的约2.2kb DNA片段和pZ564的约2.6kb DNA片段，连接起来，并转化到大肠杆菌TOP10F’中。得到的正确质粒称为pPX2002。当选择抗生素从氨苄青霉素换成卡那霉素时，可以看到诱导的相似时间过程和重组菌毛蛋白表达水平。

实施例4

在大肠杆菌内克隆和表达脑膜炎球菌Ⅰ类pilE

由于淋球菌和脑膜炎球菌Ⅰ类菌毛蛋白DNA和氨基酸序列的高度同源性(7)，用全细胞ELISA评估了淋球菌重组菌毛蛋白抗血清结合于脑膜炎球菌细胞表达的菌毛的能力。该抗血清表现出结合于菌株H355的脑膜炎奈瑟氏球菌带菌毛细胞的滴度为151,100。

该结合似乎是针对菌毛蛋白的，因为对该菌株全细胞裂解物的Western印迹显示，只有与菌毛蛋白共迁移的单一条带可结合此抗血清(没有显示数据)。大量其它的脑膜炎球菌菌株在全细胞ELISA中显示低滴度，但透射电子显微镜没有证明菌毛的存在。根据这些数据，决定克隆并重组表达脑膜炎奈瑟氏球菌的Ⅰ类菌毛蛋白。起初，采用了淋球菌的pilE相同的策略。除下面特别指出的外，使用实施例2中的流程。

从脑膜炎奈瑟氏球菌菌株H44/76基因组DNA扩增Ⅰ类pilE，采用以下引物：5’CCC CGC GCC ATG GAC ACC CTT CAA AAA GGT TTT ACC 3’(NMFPILE)(SEQID NO：11)，和5’GGG CCT GGA TCC GAG TGG CCG TGG AAA ATCACT TAC CGC 3’(NMRPILE)(SEQ ID NO：12)。如预计的，得到约600bp DNA的PCR产物。一份PCR反应产物用BamHI和NcoI限制性内切酶消化，插入到pTrcHisA。消化的DNA在琼脂糖凝胶上电泳，凝胶纯化DNA片段。然后将DNA片段连接起来，转化到大肠杆菌TOP10F’中。用BamHI和NcoI限制性内切酶对氨苄青霉素抗性克隆进行小质粒制备分析。表达正确限制性消化模式的克隆称为RZ1142，质粒称为pPX2003。

诱导后，当用SDS-PAGE分析全细胞裂解物时，观察到分子量约为15,000道尔顿的考马斯蓝染色多肽。用SDS-PAGE和Western印迹分析这些克隆的四种克隆的全细胞裂解物显示，存在一种蛋白，它具有适当的迁移率和与抗淋球菌菌株LB2完整菌毛的多克隆抗血清有反应性。纯化的Ⅰ类重组菌毛蛋白长度为167个氨基酸。然而，这种重组菌毛蛋白的表达水平明显低于相同条件下生长的pPX2000或pPX2003获得的水平。分析重组Ⅰ类pilE中的DNA序列显示，有大量反向重复序列，这可能解释大肠杆菌中这种蛋白低水平表达的原因。

实施例5

在大肠杆菌内构建和表达淋球菌和脑膜炎球菌Ⅰ类嵌合pilE

为了增加脑膜炎球菌菌毛蛋白的表达，将pPX2003(实施例4中所述脑膜炎球菌Ⅰ类pilE构建物)中编码前60个氨基酸的DNA以pPX2002(实施例3中所述淋球菌pilE构建物，包括7个氨基酸的信号肽)相当区域置换(SEQ ID NO：4)。除下面特别指出的外，采用实施例2中的流程。

按以下方式将脑膜炎球菌pilE基因的保守5’端区域用淋病奈瑟氏球菌菌株Pgh-1的相同区域置换，如下将BsmBI位点引入脑膜炎球菌pilE基因中：从pPX2003PCR扩增DNA，采用如下引物：5’CCG GCG CGT CTC TCA CGG CGAATG GCC CGG C3’(CL-1ESPF)(SEQID NO：13)和5’GGG CCT GGA TCCGAG TGG CCG TGG AAA ATC ACT TAC CGC 3’(NMRPILE)(SEQ ID NO：14)和Taq DNA聚合酶。将预期的PCR DNA产物直接克隆到pCR2.1(Invitrogen)中并转化入TOP10F’细胞，得到的质粒命名为pZ578。然后，将BsmBI位点引入淋球菌pilE，方法如下。所用引物为5’GCA TAA TTC GTG TCG CTC AAG GCG C3，(TRCUPFW)(SEQ ID NO：15)和5’GCC GCG CGT CTC CCG TGA TTC AGGTAA TAC TCG G3’(PILEESPR)(SEQ ID NO：16)和Pfu DNA聚合酶。PCR扩增pPX2000pilE基因的5’端。然后将所得的淋球菌PCR产物和pZ578用BsmBI消化，并连接起来。再PCR扩增连接的DNA，采用5’GCA TAA TTC GTG TCGCTC AAG GCG C 3’(TRCUPFW)(SEQ ID NO：17)和5’GGG CCT GGA TCCGAG TGG CCG TGG AAA ATC ACT TAC CGC 3’(NMRPILE)(SEQ ID NO：18)引物。

DNA PCR产物具有预计的大小(约850bp)，用NcoI和BamHI消化，得到约600bp的片段。凝胶分离该片段，直接克隆入NcoI和BamHI切开的pPX2000载体中，置换淋球菌pilE基因。得到的质粒是氨苄青霉素抗性的，标记pPX2004，用于转化TOP10F’。该转化体分析显示存在期望的嵌合pilE DNA。用IPTG诱导后，与pPX2003表达的脑膜炎球菌重组菌毛蛋白量相比，构建物表达的脑膜炎球菌嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白的量显著增加。用1％辛烷基-β-D-吡喃葡萄糖苷(OG)提取及如实施例7所述纯化方案(TMAE Fractogel^TM柱，10mM Tfis^TM，pH8.5，含0.1％(w/v)Zwittergent^TM 3-14)纯化重组淋球菌菌毛蛋白，得到高纯度的脑膜炎球菌嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白(收率为约5mg/g湿细胞重量)。用SDS-PAGE和激光密度仪分析时，该物质的纯度大于90％。SDS-PAGE显示约15,000道尔顿大小的一个主条带。脑膜炎球菌嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白的长度也为167个氨基酸，包括7个氨基酸的信号序列，如该纯化蛋白氨基端的36个残基测序所得显示。

实施例6

在大肠杆菌内构建和表达淋球菌和脑膜炎球菌Ⅱ类嵌合pilE

脑膜炎球菌Ⅱ类pilE的初期克隆包括从带菌毛的脑膜炎奈瑟氏球菌菌株FAM18细胞分离染色体DNA和在PCR反应中扩增Ⅱ类pilE DNA。Ⅱ类pilE基因的扩增采用如下识别完整菌毛蛋白(包括前导序列)3’和5’端的引物：5’GCGGCC GCC ATG GAA GCA ATC CAA AAA GGT TTC ACC C3’(PILE2FWD)(SEQID NO：19)和5’GCG GCC GGA TCC GGT CAT TGT CCT TAT TTG GTGCGG C3’(PILE2REV)(SEQ ID NO：23)。用与实施例2相似的策略，得到的PCR产物在pilE编码区域的起始处含有一个NcoI位点，在末端含有一个BamHI位点。出于克隆考虑，将NcoI位点引入该基因。这导致信号序列第二个氨基酸的改变，从赖氨酸(AAA)变为谷氨酸(GAA)。如前所述，预计这种变化对抗原性或免疫原性没有任何作用。将PCR产物克隆到pCR2.1克隆载体(Invitrogen)中，连接并转化到大肠杆菌TOP10F’中。在含有100μg/mL氨苄青霉素的平板或含有50μg/mL卡那霉素的平板上筛选菌落。从这些转化体的过夜培养物中分离出质粒DNA，并用酶EcoRI限制性内切进行分析。

克隆#8，命名为pPX8001，用作pilE基因的来源。pPX8001和pTrcHisC(Invitrogen)的质粒DNA各用NcoI和BamHI限制性内切酶消化，凝胶分离所得的DNA片段，连接并转化入大肠杆菌TOP10F’中。筛选氨苄青霉素抗性菌落后，分离新转化体的质粒DNA，用BamHI和NcoI限制性内切酶进行DNA限制酶切分析。对两个具有正确限制模式的克隆作DNA序列分析。这两个克隆都具有正确的DNA序列，命名为pPX8002。

为了测定重组Ⅱ类菌毛蛋白的表达，将10mL含有这些克隆的培养物，pPX8002，在50mL管中生长，其中的SOB含有100μg/mL氨苄青霉素和12μg/mL四环素，直到A₆₀₀=1.0。加入终浓度1mM的IPTG诱导了重组蛋白的表达，培养继续3小时。当被诱导细胞的全细胞裂解物用SDS-PAGE分离并用考马斯蓝染色时，没有测到新(诱导)的条带。这提示FAM18 pilE基因产物表达的水平低于那些考马斯蓝(染色)识别的水平。当FAM18 pilE克隆入pET17b质粒并转化入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(有或无pilE信号序列)时，没有测到重组蛋白的明显表达。当脑膜炎奈瑟氏球菌两个其它菌株(NmB,2996)的Ⅱ类pilE基因克隆入相同的pTrcHis质粒和TOP10F’表达系统中时，得到类似的结果。确定的，根据PCR和测序数据，也测到菌株NMB和2996表达Ⅱ类菌毛蛋白。在以染色体DNA或细胞作为模板的分离反应中，从一些脑膜炎奈瑟氏球菌菌株扩增pilE基因，采用Ⅰ类的引物(NMFPILE和NMRPILE)和Ⅱ类的引物(PILE2FWD和PILE2REV)。将PCR产物克隆入pTrcHisC并测序，或直接测序。进行了序列对比，类似H44/76菌株的序列被定为Ⅰ类，类似于FAM18菌株的序列被定为Ⅱ类。并非从所有扩增菌株都能获得序列。根据PCR数据进行了初步分类。Ⅰ类菌株是那些用Ⅰ类引物而不是用Ⅱ类引物获得正确大小PCR产物的菌株，而Ⅱ类菌株是那些用Ⅱ类引物而不是用Ⅰ类引物获得正确大小PCR产物的菌株。

根据脑膜炎球菌Ⅰ类菌毛蛋白的试验，将编码Ⅱ类pilE前60个氨基酸(保守氨基端区域)的区域用淋球菌菌株Pgh3-1的相应区域置换。所得嵌合pilE的表达用各种不同的启动子在大量的大肠杆菌表达菌株中进行研究。实验菌株包括：PR13(RNA缺陷型)、BL21(蛋白酶缺陷型)、KS474(周质蛋白酶缺陷型)、AD494(Novagen，其允许在胞质中形成二硫键)和TOPP的三个菌株(Stratagene，可用于难表达蛋白的非K-21菌株)。在所有的实验中，在考马斯蓝染色的SDS-PAGE中没有测到重组蛋白。研究了另一个表达质粒pET17b(包括一个T7启动子)得到类似的结果。

应注意的是，pPX8002中的天然Ⅱ类ilE基因序列终止于碱基447。距天然脑膜炎球菌Ⅱ类pilE终止位点下游(3’)的DNA序列，核苷酸447到519，含有反向的重复序列(其可能形成茎和环结构)。因为茎和环结构可能是转录的有效终止子，所以假设pPX8002中该附加3’序列(74碱基)的缺少可能影响嵌合Ⅱ类pilE信息在大肠杆菌中的转录。所以，所有后来的克隆都恢复该下游3’末端序列。

将脑膜炎球菌菌株Ⅱ类pilE基因的各个部分用淋球菌菌株Pgh3-1 pilE基因的相应区域系统置换，目的是鉴定抑制表达的区域。置换区域从5’或3’端开始，并逐渐扩大。还构建了5’和3’端的双置换，直到天然pilE Ⅱ类只残留下84个核苷酸的内部区域。该区域也被置换，结果重新构建了rGC，并且如预期的那样该克隆以相似于pPX2000的考马斯蓝染色水平表达了重组菌毛蛋白。FAM18 pilE基因的以下区域(以核苷酸号列出)用Pgh3-1的相应区域(在括号内列出)置换：单区域置换的是1-108(1-108)、1-181(1-181)、1-294(1-282)、439-499(478-553)、379-519(367-553)、295-519(283-553)、295-378(283-366)；双区域置换是1-294(1-282)&379-519(367-553)、1-181(1-181)&439-499(478-553)、1-181(1-181)&379-519(367-553)、1-294(1-282)&439-499(478-553)。

当在大肠杆菌TOP10F’中用pTrcHis表达系统表达这些构建物时，两个构建物产生的蛋白水平可用考马斯蓝检测：第一个含有核苷酸379-519(包括二硫环和3’突出端)的置换；第二个含有核苷酸1-181(包括保守5’区域)和379-519(包括二硫环和3’突出端)的置换。因为仅置换5’区域不能导致重组蛋白的表达，还因为第一构建物保留了天然脑膜炎球菌菌毛蛋白序列的大部分，选出该构建物(核苷酸379-519)用于进一步的研究。由于脑膜炎球菌和淋球菌蛋白的氨基酸序列在该区域明显不同，有文件(17,18)指出该二硫环经历了显著的抗原变异。所以，任何针对该区域(即二硫环)的免疫应答将表现出脑膜炎球菌菌株间极小的交叉反应性。因为淋球菌插入物是脑膜炎球菌二硫环大小的两倍(39残基对18残基)，产生的嵌合蛋白在SDS-PAGE凝胶上迁移的表观分子量约为19,000道尔顿。

该嵌合基因的构建方法如下。扩增pPX8002(FAM18 Ⅱ类pilE)得到5’片段，采用如下引物：5’GCG GCC GCC ATG GAA GCA ATC CAA AAA GGT TTCACC C3’(PILE2FWD)(SEQID NO：19)和5’GCC GCG CGT CTC CGA ACCGGA GTT TTG TTT GCC 3’(REV-CYS)(SEQ ID NO：20)。从pPX2000扩增得到淋球菌二硫环(即淋球菌基因的3’端)，采用引物5’CCG GGC CGT CTCGGT TCG GTA AAA TGG TTC TGC 3’(FWD-CYS)(SEQ ID NO：21)和5’GGG CCT GGA TCC GTG GGA AAT CAC TTA CCG 3‘(PILEREV)(SEQID NO：22)。分别纯化得到的PCR产物，用限制性内切酶BsmBI消化，而后连接形成全长嵌合pilE，再用引物PILE2FWD和PILEREV扩增。该PCR产物用限制性内切酶NcoI和BamHI消化，连接入一个相似限制的pTrcHisC载体，转化入TOP10F’感受态细胞中。

培养转化体，并用限制性内切酶NcoI和BamHI分析。用限制性内切酶StuI分析了具有正确大小插入物的四个克隆。其中，三个具有正确的限制图。测定了具有正确限制模式三个克隆中两个的序列。克隆#5具有正确的DNA序列，命名为pPX8017。该克隆含有的核苷酸序列列于SEQ ID NO：3中，其中核苷酸1-378来自脑膜炎奈瑟氏球菌和核苷酸379-510来自淋球菌。

在50mL管内用10mL培养基检查了表达。细胞在SOB中生长(该SOB添加有100μg/ml氨苄青霉素和12μg/ml四环素)直到A₆₀₀约为1.0。加入终浓度为1mM的IPTG诱导培养物。让生长继续3-4小时，然后通过离心(13，689×g，20分钟，4℃)收集该时间点的细胞，-20℃保存。对于发酵罐，用平板的过夜培养物或冰冻存储液接种含有500mL培养基的摇瓶，再生长过夜。将该液体培养物接种入含有8.9L培养基的Biostat B发酵罐(Braun Biotech,Allentown,PA)中。当用终浓度为1％(w/v)葡萄糖补充含有HySoy^TM的培养基时，发酵罐中的细菌生长提高。当培养物达到A₆₀₀=4.0-6.0时，加入终浓度为1mM的IPTG，让细胞再生长2-4小时然后离心(13,689×g,20分钟,4℃)收集细胞。丢弃培养液，细胞沉淀-20℃保存。通过IPTG的诱导，嵌合Ⅱ类重组菌毛蛋白的增加是很显著的。

在十二烷基磺酸钠(SDS-PAGE)存在下用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析了被诱导的培养物样品。用考马斯蓝染色可观察到重组脑膜炎球菌嵌合Ⅱ类菌毛蛋白(表观分子量约19,000道尔顿)，其鉴定通过用针对一种淋球菌肽(Glu AlaIle Leu LeuAla Glu Gly Gln Lys Ser Ala Val Thr Glu Tyr Tyr Leu Asn His Gly Lys)(SEQ ID NO：24)的多克隆抗血清作Western印迹得到证明，该肽位于Ⅱ类菌毛蛋白氨基端的保守区域。脑膜炎球菌嵌合Ⅱ类重组菌毛蛋白长度为170个氨基酸(包括信号肽，SEQ ID NO：4)，其中氨基酸1-126来自脑膜炎奈瑟氏球菌，氨基酸127-170来自淋球菌。

实施例7

从大肠杆菌分离和纯化重组淋球菌菌毛蛋白

用以下步骤纯化上述实施例2和3中得到的重组淋球菌菌毛蛋白。本步骤同样可用于纯化实施例4中得到的脑膜炎球菌重组菌毛蛋白，并可用于初步纯化实施例5中得到的脑膜炎球菌嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白。随后，如下述实施例8中所述改进了脑膜炎球菌嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白的分离步骤。表达重组菌毛蛋白的大肠杆菌的亚细胞分级分离显示，该蛋白结合于细胞膜上，更可能是内膜，因为1％(v/v)Triton^TMX-100能够溶解该蛋白。当尝试了在存在0.05-0.1％(v/v)Triton^TMX-100时除去污染的大肠杆菌蛋白时，发现低于pH9.5时重组菌毛蛋白不能牢固地结合到离子交换柱上。所以，检验了大量去污剂从大肠杆菌膜制备物中选择性溶解重组菌毛蛋白的能力。

将从lL培养物中获得的细胞沉淀，(约5g湿重)通过加入30mL 10mM Hepes(pH7.2)(Research Organics,Cleveland,OH)和lmM EDTA使其融解，用Microfluidizer细胞匀浆器(Microfluidics International Corp.,Newton,MA)裂解细胞。离心(12,000×g,10分钟)澄清裂解物和沉淀膜(288,652×g 1小时)。将膜垂悬于33mL 10mM Hepes(pH7.4),lmM MgCl₂中并用以下去污剂的一种在室温下抽提1小时：(a)Triton^TM X-100(Calbiochem-Novabiochem International,SanDiego,CA)，(b)还原的Triton^TM X-100(Calbiochern)，(c)辛烷基-β-D-吡喃葡萄糖苷(OG)(Calbiochem),(d)Zwittergent^TM 3-8(Z3-8)(Calbiochem),(e)Zwittergent^TM3-10(Z3-10)(Calbiochem),(f)Zwittergent^TM 3-12(Z3-12)(Calbiochem),(g)Zwittergent^TM 3-14(Z3-14)(Calbiochem),(h)Empigen BB^TM(Calbiochem)或(i)Tween^TM 80(ICN,Cleveland,OH)。

Empigen BB^TM(1％v/v)、Zwittergent^TM 3-10(1％w/v)、还原的Triton^TM X-100(1％v/v)、带有Zwittergent^TM 3-10(1％w/v)或3-14(0.1％w/v)的辛烷基葡糖苷(1％v/v)分别选择性提取获得了重组菌毛蛋白(含有最微量的大肠杆菌蛋白污染)。Zwittergent^TM 3-12，即使是0.1％(w/v)，溶解了重组菌毛蛋白和大量的大肠杆菌蛋白。Triton^TM 80在测试的任何一个浓度都不能提取到重组蛋白(0.1-1％v/v)。

通过离心(288,652×g 1小时)，从不溶解的膜物质中分离出溶解的蛋白。上清液(含有重组菌毛蛋白)在4℃透析过夜，透析液用10mM Tris^TM(pH 8.5)含有以下非离子去污剂的一种：(a)0.1％(w/v)Zwittergent^TM 3-14,(b)1％(w/v)Zwittergent^TM 3-10或(c)1％(w/v)OG。将透析的物质在Fractogel^TM EMD TMAE-650(S)(EM Separations Technology,Wakefield,RI)柱上分级分离，该柱已用10mMTris^TM(pH8.5)和各去污剂平衡。用含有适当去污剂的以10mM Tris^TM(pH 8.5)，配的NaCl线性梯度0-0.2M，来洗脱结合的蛋白。混合含有重组菌毛蛋白的组份，分析纯度和蛋白含量。偶尔为了增加重组菌毛蛋白的纯度，将混合的物质用起始缓冲液透析，并在TAME柱上第二次分级分离。

从柱上选择性洗脱的重组菌毛蛋白，通过考马斯蓝染色的SDS-PAGE作激光密度分析评价，是高度纯化的(＞90％匀质)。当用1％(w/v)Zwittergent^TM 3-10，1％(w/v)OG或0.1％(w/v)Zwittergent^TM 3-14进行提取和柱层析分离时，得到相似的结果。重组菌毛蛋白的收率(是大肠杆菌蛋白总量的主要部分)在用SOB培养基1.5L摇瓶生长的培养物中约为10mg/L。当重组大肠杆菌(含pPX2002)用HySoym^TM为基础的培养基在发酵罐中生长时，纯化的重组菌毛蛋白的收率增加到约30mg/L培养物，相应于每克细胞质量7mg重组菌毛蛋白。当发酵罐中含有1％葡萄糖时，重组菌毛蛋白的总收率增加到约100mg/L。

将纯化的重组菌毛蛋白用含0.05％(w/v)Z3-14的10mM磷酸钠、140mMNaCl(pH 7)(PBS)透析，无菌过滤，4℃保存或-20℃冻存。

实施例8

从大肠杆菌分离和纯化脑膜炎球菌嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白

如实施例2所述，大规模培养含pPX2004的大肠杆菌细胞在Biostat B发酵罐中生长。将细菌细胞(约88克湿重大肠杆菌pPX2004)重悬浮于440mL l0mMHepes、1mM EDTA(pH 7.5)中,用Microfluidizer Model 110Y(Microfluidics Corp.,Newton,MA)破裂。破裂的细胞通过离心(6,084×g,20分钟,10℃)澄清。收集上清液，通过离心(205,471×g,1小时,10℃)分离膜组份。沉淀用匀浆器重悬浮于220mL 10mM Hepes,1mM MgCl₂,1％(w/v)辛烷基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pH 7.5)中，并室温搅拌90分钟。离心悬浮液(205,471×g,1小时,10℃)。离心后，将含有溶解的嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白的上清液通过0.22μ Nalgene真空抽滤膜，4℃保存。用浓NaOH调节辛烷基葡萄糖苷提取物的pH到pH 8.5,然后装入200mL TMAE Fractogel^TM柱上(EM Separations Technology,Gibbstown,NJ)，该柱已用25mM Tris^TM、0.1％(w/v)Zwittergent^TM 3-14(pH 8.5)平衡。用补加的400mL平衡缓冲液从柱上洗去不结合的蛋白。重组菌毛蛋白的洗脱用25mMTris^TM、0.1％(w/v)Zwittergent^TM 3-14(pH 8.5)，配的10倍柱容积的线性梯度NaCl(0-0.2M NaCl)，流速10.0mL/分钟。混合含有嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白的组份，用dH₂O以1：1稀释，装入100mL 40μm瓷羟基磷灰石柱(Bio-Rad,Hercules,CA)(已用10mM NaPO₄、0.1％(w/v)Zwittergent^TM 3-14(pH 6)平衡)。用补加的200mL平衡缓冲液从柱上洗去不结合的蛋白。嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白的洗脱用含有0.1％(w/v)Zwittergent^TM 3-14的10倍柱容积线性梯度NaPO₄(10-150mM NaPO₄)液，流速5.0mL/分钟。用SDS-PAGE分析筛选各组份，混合那些含有嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白的组分。用激光密度仪检测考马斯蓝染色的凝胶，测定纯化物质的纯度至少为95％。纯化的嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白的收率约为35mg/g湿重细胞。

实施例9

从大肠杆菌分离和纯化脑膜炎球菌嵌合Ⅱ类重组菌毛蛋白

除非特别指出，所有的步骤都在室温中进行。将冷冻的大肠杆菌细胞重悬浮于10ml 10mM Hepes(pH 7.2),1mM EDTA/g细胞，用Microfluidizer细胞匀浆器匀浆破裂细胞。细胞裂解物通过离心(13,689×g,30分钟)澄清。得到的上清液继续离心(388,024×g,30分钟,4℃)。丢弃上清液，将含有膜的沉淀-20℃冷冻过夜。膜沉淀9mL/管重悬浮于10mM Hepes(pH 7.2)、1mM MgCl₂中，用1％(w/v)Zwittergent^TM 3-16(Calbiochem)提取1小时。离心悬浮液(388,024×g,30分钟)，再用上述Zwittergent^TM 3-16提取得到的沉淀。离心(388,024×g,30分钟)后，将沉淀重悬浮于9mL 50mM Tfis^TM(pH 8.0)、5mM EDTA中，用1％(w/v)N-月桂基十二烷基肌氨酸钠(Sigma)室温提取过夜(轻微振荡)。这导致脑膜炎球菌嵌合Ⅱ类重组菌毛蛋白溶解。通过离心(388,024×g,30分钟)除去不溶物质，弃之。在含有脑膜炎球菌嵌合Ⅱ类重组菌毛蛋白的上清液中加入终浓度为1％(w/v)的Zwittergent^TM 3-14，并用50mM Tris^TM(pH 8.0)、10mM EDTA、1％Zwittergent^TM 3-14透析该物质过夜。取一等份(1mL,0.3mg蛋白)透析物通过MonoQ^TM(Pharmacia,Piscataway,NJ)柱(5×10mm)，该柱已用50mM Tris^TM(pH8.0)、10mM EDTA、1％Zwittergent^TM 3-14平衡，流速为0.5mL/分钟。合并含有嵌合Ⅱ类重组菌毛蛋白不结合物质，用10mM NaPO₄(pH 6.8)、1％(w/v)Zwittergent^TM3-14透析过夜。该物质的纯度约为80％，用于下面实施例26和27所述的研究中。使该物质通过1mL羟基磷灰石柱(Bio-Rad)进一步纯化，该柱已用10mMNaPO₄(pH 6.8)、1％(w/v)Zwittergent^TM 3-14平衡。用含有1％(w/v)Zwittergent^TM 3-14的线性梯度0-0.5M NaPO₄液洗脱纯化的脑膜炎球菌嵌合Ⅱ类蛋白。用SDS-PAGE筛选各组份嵌合Ⅱ类重组菌毛蛋白(凝胶用考马斯蓝或银染色)。两种分析都显示，存在单一的多肽条带，其分子量约为19,000道尔顿。通过激光密度分析聚丙烯酰胺凝胶显示该物质的纯度大于95％。

实施例10

淋球菌重组菌毛蛋白的分析方法

用二金鸡纳酸蛋白试验(Pierce,Rockford,IL)测定蛋白含量，以BSA为标准。蛋白制备物的纯度用考马斯亮蓝染色聚丙烯酰胺凝胶(存在SDS时电泳)(SDS-PAGE)，并用Personal Densitometer SI(Molecular Devices)进行激光密度分析而确定。制品中菌毛蛋白的鉴定用实施例2所述的单克隆抗体通过Western印迹证实，此单抗是针对淋球菌菌株P9的纯化菌毛的(Biospacific)。菌毛蛋白的N端序列用Applied Biosystems 477A蛋白测序测定。当对纯化的重组菌毛蛋白进行N端测序时，经常测到两个序列。主要的序列代表完整的菌毛蛋白，包括7个氨基酸前导序列。组成10-20％样品的次要序列为重组菌毛蛋白，其缺少了前导序列，序列从苯丙氨酸(成熟淋球菌菌毛蛋白的N端残基)开始。对于这两种重组菌毛蛋白形式，氨基端残基的测序给出的结果与从DNA序列推定的序列相一致。

用Finnagan MAT Lasermat^TM 2000(San Jose,CA)，以基质辅助的激光解吸离子化飞行时间(MALDI-TOF)质谱分析法，测定了重组菌毛蛋白的质量。用马肌红蛋白校准该仪器到其期望质量(16,951.5道尔顿)的0.01％内。重组菌毛蛋白与等体积的氰基-4-羟基肉桂酸基质(10mg/mL,70：30乙脲：0.1％(v/v)三氟乙酸/水中)混合。将一份该混合液(1μL)存储于样品期，风干，然后作MALDI-TOF质谱分析。平均15次分析(每次分析为10次注料的总和)的数据，来确定重组菌毛蛋白的质量。测定的重组菌毛蛋白(带信号肽)分子量为18,000道尔顿，与根据氨基酸成分预计的分子量(17,981)相当。每批都测到质量为17,232道尔顿(平均)的一个小峰。重组菌毛蛋白两种形式分子量的差别(769道尔顿)在于前导序列前六个氨基酸(Met Asp Thr Leu Gln Lys)(SEQID NO：2，氨基酸1-6)的丢失，其分子量为774道尔顿。

用分析级Superose^TM 12柱(Pharmacia,Piscataway,UJ)(以含有0.05％(w/v)Zwittergent^TM 3-14的PBS平衡)，作大小排阻层析，得到极不同的重组菌毛蛋白表观分子量。在这些条件下，该蛋白的洗脱位置相应于分子量为68,899。这提示该重组蛋白凝聚。然而，从大小排阻柱洗脱蛋白在很大程度上受到蛋白形状的影响。速度沉降离心实验的结果显示，重组菌毛蛋白在溶液中的分子量约为45,000道尔顿。为了除去去污剂(Zwittergent^TM 3-14)，重组蛋白用PBS充分透析。透析的重组蛋白表现为可溶，且在高速离心(122,000×g,1小时)也不沉淀。没有试图证明是否可从重组蛋白中完全除去去污剂。以PBS作凝胶过滤分析该物质，表明该蛋白的表观分子量为452,349道尔顿。这提示它经历了进一步凝聚。没有确定二种聚合体中亚基的数量。

452,349只能视为一个估计的值，因为蛋白可能依旧是处于微团中，如同不知去污剂是否从样品中被完全去除。鉴于重组菌毛蛋白在配制成疫苗时稀释了约15-30倍的事实，看来很可能疫苗中的重组菌毛蛋白的表观分子量约为450kD。

实施例11

从重组菌毛蛋白制备免疫血清

通过给豚鼠(雌性，200g)皮下免疫注射20μg混合有佐剂的纯化的淋球菌重组菌毛蛋白进行了免疫原性的研究。研究的佐剂为：(a)以PBS(pH6)配的Stimulon^TM QS-21(25μg/剂量)；(b)以PBS(pH7)配的磷酸铝(Lederle Laboratories,Pearl River,NY,100μg/剂量)；或(c)单用PBS(pH 7)。最初，动物在第0、4和8周免疫接种，在第0、4、6和10周采血清。免疫应答时间过程的分析显示，第8周作的第三次疫苗接种不增强免疫应答，因此后来用重组菌毛蛋白作的研究结束于第六周的采血。

为了研究佐剂调节淋球菌重组菌毛蛋白免疫应答的能力，小鼠(雌性，8周岁，每组5或10只)在第0、4和6周皮下免疫接种1-10μg纯化的蛋白，在第0、4、6和8周收集血清。在第8周进行阴道灌洗，将RPMI 1640(75μL)滴注入阴道并抽吸3-4次。合并每组灌洗液，将50μL胎牛血清加入到每个合并液中。

对于脑膜炎球菌嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白，小鼠只在第0和4周接受免疫接种，在第0、4和6周收集血清。在小鼠中研究了所有重组菌毛蛋白胃肠道外的免疫原性，研究了以下佐齐：(a)以PBS(pH6)配的Stimulon^TM QS-21(25μg/剂量)；(b)以PBS(pH7)配的磷酸铝(Lederle Laboratories,Pearl River,NY,100μg/剂量)；(c)以PBS(pH7)配的MPL^TM(50μg/剂量)(d)以PBS(pH7)配的磷酸铝(100μg/剂量)和MPL^TM(50μg/剂量)或单用PBS(pH 7)。

对于脑膜炎球菌嵌合Ⅱ类重组菌毛蛋白，第0和4周豚鼠接受20μg蛋白和以PBS(pH6)配的Stimulon^TM QS-21(25μg/剂量)佐剂，在第0、4和6周收集血清。

评估了重组表达的菌毛(淋球菌或脑膜炎球菌嵌合Ⅰ类)诱导粘膜免疫应答的能力方法是对小鼠鼻内免疫接种(a)2.5μL含1或10μg淋球菌重组菌毛蛋白的盐水(有或无1μg天然霍乱毒素)，或(b)5μg嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白稀释于10μLPBS(pH 7)，有或无1μg突变体CT-CRM，E29H霍乱毒素。在第0、2和3周给予免疫注射。

实施例12

抗淋球菌重组菌毛蛋白免疫应答的Western印迹分析

按照实施例11所述的方案，用纯化的淋球菌重组菌毛蛋白免疫接种豚鼠。首先用Western印迹分析了免疫接种过淋球菌重组菌毛蛋白的豚鼠的抗血清，(没有显示数据)。这些印迹显示抗淋球菌重组菌毛蛋白的抗血清识别了对应于带菌毛淋球菌细胞全细胞裂解物中菌毛蛋白的一个条带；同一淋球菌菌株无菌毛细胞裂解物中没有染色条带。

从淋球菌菌毛蛋白寡聚物免疫接种的豚鼠的抗血清中得到了可比较数据。如上述(4)通过解离完整的菌毛获得了菌毛蛋白寡聚物。简单而言，这包括将完整的菌毛在37mM磷酸钠(pH 12)中4℃透析48小时，然后用50mM Tris^TM、145mMNaCl(pH 8.0)透析，然后离心(100,000×g,1小时)澄清菌毛蛋白寡聚物。离心后，菌毛蛋白寡聚物保留在上清液中。与抗淋球菌重组菌毛蛋白的抗血清相比，菌毛蛋白寡聚物抗血清能与带菌毛的细胞裂解物结合，同时也结合带和不带菌毛细胞裂解物的许多其它条带(没有显示数据)。这些条带代表了菌毛蛋白寡聚物制品中的污染物，推测它们不与菌毛结合。

实施例13

重组淋球菌菌毛蛋白ELISA

通过ELISA测定了纯化的蛋白或细菌细胞的终点滴度。在所有ELISA操作中，除非特别指出，均在室温中培育1小时。终点滴度被定义为吸光值比空白孔(不含第一抗体)大0.10的外推稀释度。对于豚鼠抗血清分析，将纯化的重组菌毛蛋白稀释于0.1M Tris^TM(pH 8)，终浓度为1μg/mL。每份(100μL)加入到微量滴定板(ImmulonIⅡ,Nunc,Naperville IL)的孔中，在4℃培养过夜。用Skanwash 300滴定板洗涤器(Skatron Instruments,Alexandria,VA)，以含有0.05％(v/v)Tween^TM-20(PBS-T)的PBS洗涤5次。各用200μL含1％(w/v)BSA的PBS-T封闭诸孔，洗涤，各孔加入一份抗血清(稀释于含0.1％(w/v)BSA的PBS-T)。洗涤滴定板，用100μL偶联了兔抗豚鼠IgG(重链或轻链)的碱性磷酸酶检测结合的第一抗体(Zymed Laboratories,South San Francisco,CA)，此偶联物1∶2000稀释于含0.1％(w/v)BSA的50mM Tris^TM(pH 8)中。洗涤滴定板，用100μL/孔磷酸对硝基苯(Sigma)(2mg/mL在0.5M二乙醇胺中,0.25mM MgCl₂,pH9.8)进行显色。30分钟后，加入50μL 3N NaOH终止反应。用Thermomax ELISA平板读数仪(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)读取405nm吸光度。

所有用重组菌毛蛋白免疫接种的动物都有很好的应答反应，用抗原ELISA显示如表1。

                                表1混合的抗淋球菌重组菌毛蛋白豚鼠抗血清与纯化的重组淋球菌菌毛蛋白结合的                              终点滴度*

*三批不同的重组菌毛蛋白作为免疫原。豚鼠在第0和4周免疫接种(皮下注射)，并在第0、4和6周采血。对混合的血清进行分析。

佐剂对免疫应答的影响

在小鼠中研究了以下佐剂对淋球菌重组菌毛蛋白免疫应答的影响：(a)以PBS(pH6)配的Stimulon^TM QS-21；(b)以PBS(pH7)配的磷酸铝；(c)以PBS(pH7)配的MPL^TM(d)以PBS(pH7)配的磷酸铝和MPL^TM；或单用PBS(pH 7)。为了分析小鼠抗血清，如下改进了抗原ELISA流程。微量滴定板(Costar EIA/RIA，Coming Costar,Cambridge,MA)用100μL含有1μg/mL重组菌毛蛋白的PBS37℃包被过夜。用Skantron 300滴定板洗涤器以含有0.1％(v/v)Tween^TM-20的PBS洗涤板5次。用含有0.1％(w/v)明胶和0.02％NaN₃的PBS封闭各孔。第一抗体用PBS稀释，该PBS含有0.1％(w/v)明胶、0.05％(v/v)Tween^TM-20(PBS-TG)和0.02％(w/v)NaN₃，每份100μL在微量滴定板中培育2小时。洗涤后，用生物素酰化的兔抗小鼠IgG(Fc区域)(Brookwood Biomedical,Birmingham,AL)以PBS-TG和0.02％(w/v)NaN₃1∶8000稀释检测第一抗体。洗涤平板，依次用以链霉亲和素偶联的辣根过氧化物酶(Zymed Laboratories)1∶5000稀释于PBS-TG和0.02％(w/v)NaN₃(培养30分钟)检测第二抗体。洗涤平板，用含有0.03％(v/v)过氧化氢的0.1M柠檬酸盐(pH 4.2)配的0.5mg/mL2,2’-连氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)显色30分钟，用SLT 340 ATTC微板读数仪(SLTLabinstruments,Research Triangle Park,NC)在405nm监测。用双对数坐标图描绘出数据，如上述确定终点滴度。

当重组菌毛蛋白用MPL^TM为佐剂时，在小鼠中得到体液免疫应答，在数量级上类似于用Stimulon^TM QS-21(表2A)观察到的。分析同一动物的阴道冲洗物也显示，这些动物的阴道冲洗物有明显的IgG滴度(表2B)。

              表2A佐剂对淋球菌重组菌毛蛋白免疫应答的影响*                体液：

              表2B佐剂对淋球菌重组菌毛蛋白免疫应答的影响*              阴道灌洗液**

*Balb/c小鼠(每组5只)在第0、4和6周免疫接种10μg重组菌毛蛋白，其中佐剂如上述。动物在第0、4、6和8周采血。对第8周的混合血清作分析。第0周的终点滴度≤5,000。

**在第8周获得的混合阴道灌洗液。

***用风干细胞的全细胞ELISA。

P+：带菌毛的细胞。P-：带菌毛亲代细胞衍生的无菌毛突变体。

实施例14

淋球菌全细胞ELISA

在全细胞ELISA中证实了，在完整的装配的菌毛中发现重组菌毛蛋白表达的明显数目的交叉反应表位，其中抗纯化的重组菌毛蛋白的抗血清显示出对众多表达异源菌毛的淋球菌菌株的高滴度。豚鼠抗血清结合活淋球菌细胞的能力用如下方案测定。微量滴定板(ImmunolonⅡ)用100μL含有0.01％(w/v)聚-L-赖氨酸(Sigma)的PBS4C培育过夜。用Dacron拭子将前夜的细菌琼脂培养物收获入PBS中，将悬液的浊度调节到A₆₀₀=1.0。除去微量滴定板中的聚赖氨酸液，将每份100μL细菌悬液加入到孔中。用手动式Nunc洗涤器以PBS洗涤板5次，用200μL含有1％(w/v)BSA的PBS(PBS-B)封闭。然后，用PBS洗涤板5次，将每份100μL以含有0.1％(w/v)BSA的PBS稀释的抗血清加入到孔中。用PBS洗涤5次后，用100μL上述适当的碱性磷酸酶偶联物(以1∶2000稀释于含有0.1％BSA的PBS中)检测结合的抗血清。洗涤板，如上述显色并进行吸光度读数(30分钟显色)。

在用全细胞ELISA分析时，抗重组菌毛蛋白的豚鼠抗血清结合于各地理区域的带菌毛的细菌分离物，但不结合于同一淋球菌菌株的相应无菌毛的细胞(表3)。

                          表3抗重组菌毛蛋白的豚鼠抗血清结合各菌株活淋球菌细胞的终点滴度*

*三批不同的重组菌毛蛋白作为免疫原。如上述免疫接种豚鼠(皮下照射)并且采血。分析第6周的混合血清。第0周血清的终点滴度≤250。

P+：带菌毛的细胞。P-：带菌毛亲代细胞衍生的无菌毛突变体。

用微量滴定板进行抗重组菌毛蛋白(表2)小鼠抗血清的全细胞ELISA分析，其中用如下方案将孔中的细菌完全干燥。用Dacron拭子将前夜的细菌琼脂培养物收获于PBS中，并将细菌悬液的浊度调节到A₆₀₀=0.1。每份(100μL)细菌悬液加入到孔中，37℃风干板。在蒸发掉所有液体后，密封板，4℃中保存到使用。剩下的试验采用上述小鼠抗血清的抗原ELISA流程。全细胞ELISA数据(表2和3)提示，重组菌毛蛋白诱导的抗体结合于带菌毛淋球菌表面的保守表位。

实施例15

诱导抗淋球菌重组菌毛蛋白的粘膜免疫应答

因为淋病是生殖道粘膜的一种疾病，有兴趣检验诱导粘膜免疫应答的粘膜免疫能力。按如下方法实施。在第0、1和2周，用淋球菌重组菌毛蛋白盐水(1或10μg/10μL)(有或无1μg天然霍乱毒素)鼻内免疫接种小鼠。在第0、1和2周，每组5只Swiss-Webster小鼠鼻内免疫接种重组菌毛蛋白(有或无霍乱毒素)。对混合的血清进行分析。第0周的终点滴度＜50。

如表4所示，当动物用无佐剂的重组菌毛蛋白免疫接种时，在抗原ELISA中测到显著的免疫应答(第0周滴度＜300)。该应答通过添加天然霍乱毒素得到提高。

                              表4抗淋球菌重组菌毛蛋白的混合小鼠抗血清与纯化的重组淋球菌菌毛蛋白结合的                              终点滴度

然后，用抗淋球菌菌株FA1090的ELISA检验这些血清结合于完整、带菌毛淋球菌细胞的能力。如上述将这些细胞在微量滴定板上完全干燥。如表5所示，在只用菌毛蛋白中测到低的滴度(第0周滴度＜300)。加入霍乱毒素能够大大提高与带菌毛细胞的结合。

                              表5抗淋球菌重组菌毛蛋白的混合小鼠抗血清与完整的、带菌毛淋球菌细胞结合的                              终点滴度

实施例16

淋球菌免疫电镜术

采用如下流程观察了抗血清与带菌毛细菌的结合。用对数生长后期的recA-带菌毛淋球菌液体培养物一份点滴到镀金的载网中5分钟，用一张滤纸除去过量的液体。用PSB-S封闭载网5分钟，然后用含1％新鲜明胶(Fluka,Ronkonkoma,NY)的PBS封闭10分钟。然后在室温中，用稀释于PSB-B的多克隆抗血清培育载网1-60分钟。将载网浸泡在PBS-B液滴中除去没有结合的抗体(4×30秒)。将载网浸泡在一滴结合于驴抗豚鼠IgG(Jackson Research Labs,West Grove,PA)12nm的胶体金(以1∶5稀释于PBS-B)中30分钟，检测结合的第一抗体。然后如上述，在PBS-B液滴上冲洗载网5次。然后用含1％(v/v)戊二醛(ElectronMicroscopy Sciences,Fort Washington,PA)的PBS固定样品3分钟，再以蒸馏水漂洗5×1分钟，用NanoVan染液(NanoProbes,Stony Brook,NY)(pH 8)轻微染色30秒。使载网接触滤纸除去所有的液体，用Zeiss 10C透射电子显微镜，在15-75，000X以80kv加速电压检验。

如免疫电镜(图1A)所示，抗重组菌毛蛋白抗体沿着淋球菌表面的异源菌毛纤丝的长度(方向)结合。这提示体内抗体将结合于那些细菌表面存在的表位。

实施例17

淋球菌重组菌毛蛋白寡聚物的全细胞ELISA

为了鉴定那些完整菌毛(或菌毛蛋白寡聚物)重组菌毛蛋白的生化和免疫特性，将纯化的重组菌毛蛋白通过pH12的磷酸缓冲液透析转变为重组菌毛蛋白寡聚物。用全细胞ELISA，检验由该物质(重组菌毛蛋白寡聚物)诱导的抗血清结合于活的、带菌毛淋球菌的能力。如表6所示，与未处理的重组菌毛蛋白诱导产生的抗血清相比，抗重组菌毛蛋白寡聚物的抗血清对于结合各种带菌毛淋球菌细胞有非常低的滴度。这提示重组菌毛蛋白寡聚物丢失了大量通常存在于重组菌毛蛋白上的交叉反应表位。

                            表6pH12(“寡聚化”)对重组菌毛蛋白豚鼠抗血清结合于带菌毛淋球菌细胞终                       点滴度的影响*

*豚鼠(每组4只)在第0和4周，免疫接种(皮下注射)20μg重组菌毛蛋白抗原，以25μg Stimulon^TM QS-21为佐剂。分析第6周的混合的血清。

**在4℃用磷酸钠(pH 12)透析纯化的重组菌毛蛋白48小时，然后用PBS透析24小时。

实施例18

对黏附人子宫颈细胞的抑制

因为菌毛介导了淋球菌与人粘膜细胞的初级结合，所以研究了重组菌毛蛋白抗体抑制这些细菌附着上皮细胞的能力。选择了宫颈癌衍生的ME-180细胞。另外，为了使这些实验中带菌毛细菌的丛集最小化，使它们以液体悬浮培养物生长。这需要用淋球菌菌株Pgh3-1或1756的recA^-衍生物，以维持菌毛的表达。在液体培养液中生长4-5小时期间，这些recA^-菌株没有显示出显著的丛集，这使结果翻译更为容易。

在这些实验中，用ME-180细胞接种8孔槽载玻片(Nunc)，实验当天这些细胞已80-90％铺满。用拭子将recA^-淋球菌细胞的过夜培养物移入PBS(加热到37℃)中，用于接种含液体GC培养基的摇瓶，该培养基补充有0.4％(w/v)NaNCO₃，最终达到A₆₀₀=0.2。细胞培养物37℃以120RPM振荡培养约4小时，此时培养物达到A₆₀₀≌0.8。细菌细胞悬浮液以RPMI 1640作1∶8稀释，将第二排8孔槽的诸孔与300μL RPMI 1640和胎牛血清至少培育1小时。除去RPMI 1640封闭液，加入40μL抗血清或RPMI 1640(无牛血清)，然后加入260μL稀释的细菌悬浮液(≈8×10⁷ CFU)，37℃/5％(v/v)CO₂培育1小时。含有ME180细胞的孔槽载玻片用无抗菌素的RPMI 1640冲洗。然后，将预温育的细菌和抗血清混合液加到ME180细胞上，37℃温育载玻片30分钟。从子宫颈细胞单层除去含有未结合细菌细胞的培养基，用RPMI 1640轻轻冲洗诸孔3次。最后一次冲洗后，从载玻片上移去孔槽，细胞以甲醇固定30-60秒，用Wright-Giemsa染液(VWR Scientific,West Chester,PA)染色。在水中脱色后，将盖玻片覆在每个孔上。

用油浸镜头光学显微镜检验载玻片，由不知道测试血清的人拍摄典型视野的照片。由同样不知道样品种类的人来分析所得到的图片。另外，因为带菌毛淋球菌以丛集形式结合于上皮单细胞层，所以抗血清对淋球菌细胞结合的影响通过计数细菌丛而不是细菌个体来定量测量。以十次随机扫描每个孔全孔所见测定带菌毛细菌丛的数量。确定了含有免疫血清和正常血清孔之间的百分数差异。同样，该分析由不知道分析样品种类的研究者独立完成。

最初的结果显示，带菌毛和无菌毛细胞以不同的结合型式与ME180片状单层细胞结合。淋球菌带菌毛的两株菌株，典型地以细菌丛集结合于片状单层细胞中所选择的上皮细胞。相反，相应的同基因无菌毛细胞或者不结合(Pgh3-1)于或者呈现低水平、分散地结合(I756)于上皮单细胞层。所以，细菌在上皮单细胞层上的聚集与菌毛的存在相关。

另外，测试了抗Pgh3-1重组菌毛蛋白豚鼠抗血清抑制菌株Ⅰ-756带菌毛细胞结合于ME-180细胞的能力。典型图片(比较图2A(第6周)和图2B(第0周))的分析显示，抗重组菌毛蛋白的抗体显著地抑制了带菌毛淋球菌与子宫颈上皮细胞的结合。相反，与正常豚鼠血清相比，重组菌毛蛋白抗血清对同一菌株的无菌毛细胞的结合没有影响(没有显示数据)。虽然不能测定在这些条件下细菌结合的数量，但通过计数在正常或免疫血清存在时结合的细菌丛可定量分析附着情况。用此法确定了(与正常豚鼠血清相比)抗重组菌毛蛋白抗血清减少了结合于上皮细胞的细菌丛约60％。

虽然该试验没有得到易得的可量化数据，通过计数细菌丛得到的估算可能低估了抗血清的效力。这是因为其它细胞表面成份(如Opa蛋白)介导了这种结合，这不可能期望单用抗重组菌毛蛋白抗血清就能克服。

实施例19

脑膜炎球菌嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白的分析方法

用实施例10所述的分析方法分析嵌合脑膜炎球菌Ⅰ类重组菌毛蛋白。如MALDI-TOF质谱仪测定的那样，脑膜炎球菌嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白的亚基分子量为17,659道尔顿，与根据氨基酸成分预期的分子量17,676道尔顿非常相似。当该蛋白用Superose^TM 12柱(以含有0.05％(w/v)Zwittergent^TM 3-14的PBS平衡)作大小排阻层析分析时，嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白的表观分子量为69,480道尔顿。这与相同条件下分析的淋球菌重组菌毛蛋白的表观分子量(68,899道尔顿)基本相同。

用Edman降解法测定了纯化的脑膜炎球菌Ⅰ类重组菌毛蛋白的N端序列，结果(得自三个不同的样品)与预计的蛋白序列相一致。对所有序列至少测定了35个残基。

实施例20

脑膜炎球菌嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白ELISA

用实施例13和14所述的方法，用ELISA测定了抗纯化蛋白或细菌细胞抗血清的终点滴度。用分别采血的混合血清作ELISA。在脑膜炎球菌细胞上作全细胞ELISA，该细胞加热杀死(56℃，60分钟)或直接在微量滴定板上完全干燥。在620nm，将细胞悬浮液稀释到620nm吸光度为0.1，取每份100μL置于微量滴定板的孔中。使每个板在37℃或室温干燥，密封，保存于4℃直到使用。改变全细胞ELISA的流程如下：(1)将第一和第二抗血清稀释于含有0.1％(v/v)Tween^TM-20和0.1％(w/v)BSA的PBS中；和(2)用Skanwash 300滴定板洗涤器以含有0.05％(v/v)Tween^TM-20的PBS洗涤平板5次。

所有用嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白免疫接种的豚鼠应答良好，如抗原ELISA显示见表7。

                              表7脑膜炎球菌嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白抗血清与纯化的脑膜炎球菌嵌合Ⅰ类重组菌                      毛蛋白结合的终点滴度*佐剂：

*豚鼠(每组4只)在第0和4周免疫接种(皮下注射)20μg嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白，其中添加的佐剂为(a)25μg Stimulon^TM QS-21的PBS(pH 6)；(b)100μgAlPO₄盐水；或(c)单用PBS(pH 7)。动物在第0、4和6周采血。所有分析采用了混合的血清。

如表8所示，对带菌毛细胞的ELISA观察到显著的应答。

                              表8脑膜炎球菌嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白抗血清与脑膜炎球菌(菌株H355)的带菌                       毛细胞结合的终点滴度*佐剂：

*细胞加热杀死。

佐剂对免疫应答的影响

用实施例13所述的方法，在小鼠中研究了佐剂对脑膜炎球菌嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白的免疫应答的影响。如表9所示，加入Stimulon^TM QS-21实现了抗血清与脑膜炎球菌嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白结合的最显著的应答。

                               表9脑膜炎球菌嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白抗血清与纯化的脑膜炎球菌嵌合Ⅰ类重组菌                          毛蛋白结合的终点滴度*                              佐剂：

*小鼠(每组10只)在第0和4周免疫接种(皮下注射)10μg脑膜炎球菌嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白，其中添加的佐剂为(a)25μg Stimulon^TM QS-21的PBS(pH6)；(b)100μg AlPO₄盐水；(c)50μg MPL^TM的PBS(pH 7)；(d)100μg AlPO₄和50μg MPL^TM盐水；或(e)单用PBS(pH 7)。动物在第0、4和6周采血。所有分析采用了混合的血清。

如表10所示，加入Stimulon^TM QS-21也实现了抗血清与脑膜炎球菌带菌毛细胞结合的最显著的应答。

                              表10脑膜炎球菌嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白抗血清与脑膜炎球菌(菌株H355)带菌毛                       细胞结合的终点滴度*佐剂：

细胞加热杀死。

进一步分析显示了，抗嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白的抗血清能与表达Ⅰ类菌毛蛋白(在一些实验中为Ⅱ类菌毛蛋白)的脑膜炎球菌细胞结合。显示于表11中的结果是部分交叉反应的证据。

                              表11脑膜炎球菌嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白与脑膜炎球菌带菌毛细胞结合的终点滴度*                                佐剂

*细胞不经过加热杀死，而直接在微量滴定板上干燥(室温)。

实施例21

脑膜炎球菌嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白免疫电镜术观察

如下采用透射电子显微术观察了嵌合脑膜炎球菌Ⅰ类重组菌毛蛋白抗血清与脑膜炎球菌菌株H355带菌毛细胞的结合。用无菌环仔细地从脑膜炎球菌前夜培养物中挑出一个菌落，置于含有0.5-1.0mL改进的Franz培养基[1.3 g/L谷氨酸、20mg/L半胱氨酸、10g/L Na₂HPO₄·7H₂O、90mg/L KCl、6g/L NaCl、2g/L酵母透析物并且补充以葡萄糖(4g/L)、谷氨酸(100mg/L)、脱羧辅酶(200μg/L)和硝酸铁(5mg/L)]的microfuge管内。每份细胞悬浮液点样5次于镀金载网上，其中每份细胞悬浮液花了5分钟，用滤纸除去过量的液体。然后用含有4％(v/v)多聚甲醛、0.1％(v/v)戊二醛的PBS室温固定细菌细胞30分钟。载网逐一与以下物质培育：(a)PBS-B，5分钟；(b)1％(w/v)新鲜明胶PBS，10分钟；和(c)含有0.2M甘氨酸的PBS，5分钟。然后如实施例16所述，用抗脑膜炎球菌嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白抗血清检测封闭的载网。如图3A所示，抗脑膜炎球菌嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白抗体沿着菌毛的长度(方向)结合。相反，正常血清(第0周)没有显示与菌毛有任何结合(图3B)。

实施例22

脑膜炎球菌嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白抗血清与淋球菌带菌毛细胞的交叉反应性根据脑膜炎球菌Ⅰ类菌毛蛋白和淋球菌菌毛蛋白的序列类似性，在上述实施例4中已显示抗淋球菌重组菌毛蛋白的抗血清识别并结合于带菌毛的脑膜炎球菌细胞。在本实施例中，证明了抗脑膜炎球菌嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白的抗血清结合于带菌毛的淋球菌细胞。表12和13分别总结了小鼠和豚鼠实验的数据。

抗脑膜炎球菌嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白的小鼠抗血清与带菌毛淋球菌细胞结合的

                          终点滴度抗原/佐剂

                              表13抗脑膜炎球菌嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白的豚鼠抗血清与带菌毛淋球菌细胞结合的                              终点滴度                              抗原/佐剂

实施例23

用脑膜炎球菌嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白抗血清被动保护机体抵抗脑膜炎球菌菌血症

Saukkonen和Leinonen(34)最初描述的幼大鼠模型是一种评价疫苗保护机体能抗脑膜炎球菌菌血症能力的可行性动物模型。测试了抗脑膜炎球菌嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白豚鼠抗血清(以Stimulon^TM QS-21为佐剂)保护幼大鼠抵抗菌血症(由表达菌毛蛋白的脑膜炎球菌菌株造成)的能力。在第0天，Sprague-Dawley幼大鼠(4-5日龄)被动免疫接种(腹膜内注射)0.1mL抗嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白豚鼠抗血清(第6周)(以1∶5、1∶10或1∶20稀释于PBS)。对照组接受0.1mL正常豚鼠血清(第0周)(以1∶5稀释于PBS)注射。24小时后，用约5×10⁵菌落形成单位(cfu)的0.1mL带菌毛脑膜炎球菌(菌株H355)攻击(腹膜内注射)动物。攻击3小时后，处死动物，取等份心血稀释，置于GC琼脂平板上。然后在37℃5％CO₂中培育平板18-24小时。计数细菌菌落，然后确定菌血症的水平。用一种方差t检验分析方法比较了接受免疫血清(第6周)组和接受正常血清(第0周)对照组。如下表14所显示，与用正常豚鼠血清免疫接种的动物相比，用特异性抗脑膜炎球菌嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白的豚鼠抗血清被动免疫接种的动物，表现出菌血症水平呈对数级减少。该差异有统计学意义，p＜0.05。

                              表14抗脑膜炎球菌嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白的豚鼠抗血清在用带菌毛脑膜炎球菌(菌            株H355)攻击的幼大鼠中防止菌血症的能力*

**如表7所述，从豚鼠获得的抗脑膜炎球菌嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白抗血清。

**p＜0.05。

cfu±std=菌落形成单位±标准差

实施例24

诱导抗脑膜炎球菌嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白的粘膜免疫应答

在第0、1和2周，给小鼠鼻内免疫接种脑膜炎球菌嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白盐水(5μg/10μL)，其中含有或不含有交叉反应突变形式的霍乱毒素(CT-CRM，E29H)。如下表15所示，当动物用无佐剂的重组菌毛蛋白免疫接种时，在抗原ELISA中测到显著的免疫应答。加入霍乱毒素提高了该应答。

                              表15抗脑膜炎球菌嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白混合小鼠抗血清与纯化的重组脑膜炎球菌              嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白结合的终点滴度*

*分析了第4周的混合血清。第0周混合血清的IgG和IgA终点滴度＜50。

**如下进行灌洗：

支气管：用1mL RPMI 1640灌洗肺5次，然后在样品中加入50μL胎牛血清(FBS)，离心(2,000×g×5分钟)澄清，-20℃保存。鼻腔：用0.5mL RPMI 1640灌洗鼻孔一次，在样品中加入20μL FBS，然后-20℃保存。

阴道：用0.075mL RPMI 1640灌洗阴道5次，然后在样品中加入10μL FBS,-20℃保存。

实施例25

用脑膜炎球菌嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白抗血清主动保护抵御脑膜炎球菌的定居

人体内脑膜炎球菌疾病的第一步是细菌在鼻咽中定居。在这一过程中，据信菌毛在介导细菌与上皮细胞初步接触中起主要作用。许多研究者描述了新生动物鼻咽中细菌定居的过程，但没有人将其作为测试脑膜炎球菌疫苗效力的模型进行研究(35)。为了评价本发明，开发了用成熟远交小鼠作为脑膜炎球菌鼻内定居的模型。在第0、4和8周，对Swiss-Webster小鼠皮下免疫接种脑膜炎球菌嵌合Ⅰ类重组菌毛蛋白(以MPL^TM为佐剂)。在第10周，动物腹腔内注射2mg右旋糖苷铁(Sigma)，并且用10μL约1×10⁷cfu的对数生长中期的带菌毛脑膜炎球菌(同样含有40μg右旋糖苷铁)鼻内攻击。攻击后第1天，一半动物再接受腹腔内注射2mg右旋糖苷铁。攻击后第1和2天，通过将鼻组织匀浆接种于含选择性抗菌素的GC琼脂平板上，测定了鼻中活菌的数量。结果显示于表16。

                            表16用带菌毛的脑膜炎球菌菌株H355攻击的小鼠鼻匀浆中回收的活菌数(cfu)*

*所有疫苗以100μg MPL^TM/剂配制。每组由5只小鼠组成。

**鼻内攻击后的天数。

实施例26

Western印迹分析抗脑膜炎球菌Ⅱ类嵌合重组菌毛蛋白的免疫应答

采用如实施例11所述的流程，用纯化的脑膜炎球菌Ⅱ类嵌合重组菌毛蛋白免疫接种豚鼠。首先用Western印迹法分析了用脑膜炎球菌Ⅱ类嵌合重组菌毛蛋白免疫接种的豚鼠产生的抗血清(没有显示数据)。这些印迹显示，抗脑膜炎球菌Ⅱ类嵌合重组菌毛蛋白抗血清识别了相应于带菌毛脑膜炎球菌细胞(表达Ⅱ类菌毛蛋白(FAM18)或Ⅰ类菌毛蛋白(H355))的全细胞裂解物中菌毛蛋白的一个条带。相反，抗含有pTrcHis载体的大肠杆菌提取物的抗血清在Western印迹中不与任何菌毛蛋白条带反应。

实施例27

抗脑膜炎球菌嵌合Ⅱ类重组菌毛蛋白与带菌毛脑膜炎球菌细胞的结合

抗部分纯化的脑膜炎球菌嵌合Ⅱ类重组菌毛蛋白的抗血清显示能结合于同源菌株FAM18的脑膜炎球菌细胞，滴度＞36,450(第0周的滴度为473)。

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                                         序列表<110>American Cyanamid Company<120>含有重组菌毛蛋白的抗淋病奈瑟氏球菌或脑膜炎奈瑟氏球菌的疫苗<130>33377-00/PCT<140><141><160>24<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>504<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：嵌合的脑膜炎奈瑟氏球菌Ⅰ类和淋病奈瑟氏球菌序列<220><221>CDS<222>(1)..〔501)<400>1atg gat acc ctt caa aaa ggc ttt acc ctt atc gag ctg atg att gtg              48Met Asp Thr Leu Gln Lys Gly Phe Thr Leu Ile Glu Leu Met Ile Val  1              5                      10                  15atc gcc atc gtc ggc att ttg gcg gca gtc gcc ctt ccc gcc tac caa              96Ile Ala Ile Val Gly Ile Leu Ala Ala Val Ala Leu Pro Ala Tyr Gln            20                  25                  30gac tac acc gcc cgc gcg caa gtt tcc gaa gcc atc ctt ttg gcc gaa 144Asp Tyr Thr Ala Arg Ala Gln Val Ser Glu Ala Ile Leu Leu Ala Glu        35                  40                  45ggt caa aaa tca gcc gtt acc gag tat tac ctg aat cac ggc gaa tgg 192Gly Gln Lys Ser Ala Val Thr Glu Tyr Tyr Leu Asn His Gly Glu Trp    50                  55                  60ccc ggc aac aac act tct gcc ggc gtg gca tct tct tca aca atc aaa 240Pro Gly Asn Asn Thr Ser Ala Gly Val Ala Ser Ser Ser Thr Ile Lys65                  70                  75                  80ggc aaa tat gtt aag gaa gtt aca gtc gca aac ggc gtc att acc gcc 288Gly Lys Tyr Val Lys Glu Val Thr Val Ala Asn Gly Val Ile Thr Ala                85                  90                  95aca atg ctt tca agc ggc gta aac aaa gaa atc caa ggc aaa aaa ctc 336Thr Met Leu Ser Ser Gly Val Asn Lys Glu Ile Gln Gly Lys Lys Leu            100                 105                  110tcc ctg tgg gcc aag cgt caa gac ggt tcg gta aaa tgg ttc tgc gga 384Ser Leu Trp Ala Lys Arg Gln Asp Gly Ser Val Lys Trp Phe Cys Gly        115                 120                 125cag ccg gtt acg cgc acc gac gcc aaa gcc gac acc gtc gcc gcc gcc 432Gln Pro Val Thr Arg Thr Asp Ala Lys Ala Asp Thr Val Ala Ala Ala    130                 135                 140gcc aag acc gcc gac aac atc aac acc aag cac ctg ccg tca acc tgc 480Ala Lys Thr Ala Asp Asn Ile Asn Thr Lys His Leu Pro Ser Thr Cys145                 150                 155                 160cgc gac gca agt gat gcc agc taa                                 504Arg Asp Ala Ser Asp Ala Ser                165<210>2<211>167<212>PRT<213>人工序列<400>2Met Asp Thr Leu Gln Lys Gly Phe Thr Leu Ile Glu Leu Met Ile Val  1              5                      10                  15Ile Ala Ile Val Gly Ile Leu Ala Ala Val Ala Leu Pro Ala Tyr Gln             20                  25                  30Asp Tyr Thr Ala Arg Ala Gln Val Ser Glu Ala Ile Leu Leu Ala Glu        35                  40                  45Gly Gln Lys Ser Ala Val Thr Glu Tyr Tyr Leu Asn His Gly Glu Trp    50                  55                  60Pro Gly Asn Asn Thr Ser Ala Gly Val Ala Ser Ser Ser Thr Ile Lys 65                 70                   75                  80Gly Lys Tyr Val Lys Glu Val Thr Val Ala Asn Gly Val Ile Thr Ala                85                  90                  95Thr Met Leu Ser Ser Gly Val Asn Lys Glu Ile Gln Gly Lys Lys Leu            100                 105                 110Ser Leu Trp Ala Lys Arg Gln Asp Gly Ser Val Lys Trp Phe Cys Gly        115                 120                 125Gln Pro Val Thr Arg Thr Asp Ala Lys Ala Asp Thr Val Ala Ala Ala    130                 135                 140Ala Lys Thr Ala Asp Asn Ile Asn Thr Lys His Leu Pro Ser Thr Cys145                 150                 155                 160Arg Asp Ala Ser Asp Ala Ser                165<210>3<21l>510<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：嵌合脑膜炎奈瑟氏球菌II类和淋病奈瑟氏球菌<220><221>CDS<222>(1)..(510)<400>3atg gaa gca atc caa aaa ggt ttc acc ctg atc gag ctg atg atc gtc   48Met Glu Ala Ile Gln Lys Gly Phe Thr Leu Ile Glu Leu Met Ile Val  1               5                  10                  15atc gcc atc gtc ggt atc ttg gca gcc gtc gcc ctg ccc gca tac caa   96Ile Ala Ile Val Gly Ile Leu Ala Ala Val Ala Leu Pro Ala Tyr Gln            20                  25                  30gac tac acc gcg cgc gcc caa atg tcc gaa gcc ctg act ttg gca gaa   144Asp Tyr Thr Ala Arg Ala Gln Met Ser Glu Ala Leu Thr Leu Ala Glu        35                  40                  45ggt caa aaa tcc gca gtg atc gag tat tat tcc gac aac ggc aca ttc   192Gly Gln Lys Ser Ala Val Ile Glu Tyr Tyr Ser Asp Ash Gly Thr Phe    50                  55                  60ccg aac agc aat act tcc gca ggt att gct gcc tct aac gag att aaa   240Pro Ash Ser Ash Thr Ser Ala Gly Ile Ala Ala Ser Ash Glu Ile Lys65                  70                  75                  80ggt aag tat gtg gca tcg gtt aag gtt gaa ggt aat gcc tct gtt gct   288Gly Lys Tyr Val Ala Ser Val Lys Val Glu Gly Ash Ala Ser Val Ala                85                  90                  95tct att acc gct acc atg aac tct agt aat gtg aat aag gac atc aaa   336Ser Ile Thr Ala Thr Met Asn Ser Ser Asn Val Asn Lys Asp Ile Lys            100             105             110ggt aaa acc ttg gta ctc gtc ggc aaa caa aac tcc ggt tcg gta aaa   384Gly Lys Thr Leu Val Leu Val Gly Lys Gln Ash Ser Gly Ser Val Lys        115                 120                 125tgg ttc tgc gga cag ccg gtt acg cgc gac aac gcc gac aac gac gac   432Trp Phe Cys Gly Gln Pro Val Thr Arg Asp Ash Ala Asp Ash Asp Asp    130                 135                 140gtc aaa gac gcc ggc aac aac ggc atc gaa acc aag cac ctg ccg tca   480Val Lys Asp Ala Gly Asn Asn Gly Ile Glu Thr Lys His Leu Pro Ser145                 150                 155                 160acc tgc cgc gat acg tca tct gat gcc aaa                          510Thr Cys Arg Asp Thr Ser Ser Asp Ala Lys                165                170<210>4<211>170<212>PRT<213>人工序列<400>4Met Glu Ala Ile Gln Lys Gly Phe Thr Leu Ile Glu Leu Met Ile Val  1               5                  10                  15Ile Ala Ile Val Gly Ile Leu Ala Ala Val Ala Leu Pro Ala Tyr Gln            20                  25                  30Asp Tyr Thr Ala Arg Ala Gln Met Ser Glu Ala Leu Thr Leu Ala Glu        35                  40                  45Gly Gln Lys Ser Ala Val Ile Glu Tyr Tyr Ser Asp Asn Gly Thr Phe     50                  55                  60Pro Asn Ser Asn Thr Ser Ala Gly Ile Ala Ala Ser Asn Glu Ile Lys 65                  70                  75                  80Gly Lys Tyr Val Ala Ser Val Lys Val Glu Gly Asn Ala Ser Val Ala                85                  90                  95Ser Ile Thr Ala Thr Met Asn Ser Ser Asn Val Asn Lys Asp Ile Lys            100                 105                 110Gly Lys Thr Leu Val Leu Val Gly Lys Gln Asn Ser Gly Ser Val Lys        115                 120                 125Trp Phe Cys Gly Gln Pro Val Thr Arg Asp Asn Ala Asp Asn Asp Asp    130                 135                 140Val Lys Asp Ala Gly Asn Asn Gly Ile Glu Thr Lys His Leu Pro Ser145                 150                 155                 160Thr Cys Arg Asp Thr Ser Ser Asp Ala Lys                165            170<210>5<211>30<212>DNA<213>淋病奈瑟氏球菌<400>5ccccgcgcca tggataccct tcaaaaaggc                                   30<210>6<211>30<212>DNA<213>淋病奈瑟氏球菌<400>6gggcctggat ccgtgggaaa tcacttaccg                                   30<210>7<211>29<212>DNA<213>淋病奈瑟氏球菌<400>7ggctctagac tgtcagacca agtttactc                                    29<210>8<211>27<212>DNA<213>淋病奈瑟氏球菌<400>8ggctctagat tgaagcattt atcaggg                                      27<210>9<211>28<212>DNA<213>淋病奈瑟氏球菌<400>9ggctctagat aaacagtaat acaagggg                                     28<210>10<211>28<212>DNA<213>淋病奈瑟氏球菌<400>10ggctctagat tagaaaaact catcgagc                                     28<210>11<211>36<212>DNA<213>Ⅰ类脑膜炎奈瑟氏球菌<400>11ccccgcgcca tggacaccct tcaaaaaggt tttacc                            36<210>12<211>39<212>DNA<213>Ⅰ类脑膜炎奈瑟氏球菌<400>12gggcctggat ccgagtggcc gtggaaaatc acttaccgc                         39<210>13<211>31<212>DNA<213>Ⅰ类脑膜炎奈瑟氏球菌<400>13ccggcgcgtc tctcacggcg aatggcccgg c                              31<210>14<211>39<212>DNA<213>Ⅰ类脑膜炎奈瑟氏球菌<400>14gggcctggat ccgagtggcc gtggaaaatc acttaccgc                         39<210>15<211>25<212>DNA<213>淋病奈瑟氏球菌<400>15gcataattcg tgtcgctcaa ggcgc                                        25<210>16<211>34<212>DNA<213>淋病奈瑟氏球菌<400>16gccgcgcgtc tcccgtgatt caggtaatac tcgg                              34<210>17<211>25<212>DNA<213>Ⅰ类脑膜炎奈瑟氏球菌<400>17gcataattcg tgtcgctcaa ggcgc                                        25<210>18<211>39<212>DNA<213>Ⅰ类脑膜炎奈瑟氏球菌<400>18gggcctggat ccgagtggcc gtggaaaatc acttaccgc                         39<210>19<211>37<212>DNA<213>Ⅱ类脑膜炎奈瑟氏球菌<400>19gcggccgcca tggaagcaat ccaaaaaggt ttcaccc                           37<210>20<211>33<212>DNA<213>Ⅱ类脑膜炎奈瑟氏球菌<400>20gccgcgcgtc tccgaaccgg agttttgttt gcc                               33<210>21<211>33<212>DNA<213>淋病奈瑟氏球菌<400>21ccgggccgtc tcggttcggt aaaatggttc tgc                               33<210>22<211>30<212>DNA<213>淋病奈瑟氏球菌<400>22gggcctggat ccgtgggaaa tcacttaccg                                   30<210>23<211>37<212>DNA<213>Ⅱ类脑膜炎奈瑟氏球菌<400>23gcggccggat ccggtcattg tccttatttg gtgcggc                           37<210>24<211>22<212>PRT<213>淋病奈瑟氏球菌<400> 24Glu Ala Ile Leu Leu Ala Glu Gly Gln Lys Ser Ala Val Thr Glu Tyr 1              5            10            15Tyr Leu Asn His Gly Lys            20