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黄鲫蛋白肽美拉德产物的抑菌机理及对小鼠免疫功能的影响

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摘要

第一章 引言

1．1 黄鲫鱼的研究现状

1．2 抗菌肽发展概况

1．2．1 抗菌肽的由来

1．2．2 抗菌肽的来源

1．2．3 抗菌肽生物活性

1．2．4 美拉德产物抑菌性

1．3 抗菌肽抑菌机理研究

1．4 抗菌肽的研究利用

1．4．1 在食品中的应用

1．4．2 在乳制品中的应用

1．4．3 在药品中的应用

1．5 本论文研究目的与意义

第二章 HAHp-葡萄糖美拉德产物的抑菌机理

2．1 材料、试剂与仪器

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验试剂

2．1．3 实验设备

2．2 实验方法

2．2．1 黄鲫蛋白肽的制备

2．2．2 HAHp-葡萄糖美拉德产物的制备

2．2．3 扫描电镜

2．2．4 外膜内膜通透性

2．2．5 细胞内容物渗透检测

2．2．6 人工脂质体囊泡粒径分析

2．3 结果与分析

2．3．1 扫描电镜观察大肠杆菌的超微结构

2．3．2 外膜内膜渗透性检测

2．3．3 胞内乳酸脱氢酶渗透检测

2．3．4 样品与菌作用上清液中ATP含量的测定

2．3．5 人工脂质体囊泡粒径分析

2．4 本章小结

第三章 HAHp-葡萄糖美拉德产物中抗菌肽的分离与鉴定

3．1 实验材料、试剂与设备

3．1．1 材料

3．1．2 试剂

3．1．3 实验设备

3．2 实验方法

3．2．1 离子交换层析

3．2．2 分子筛过滤分离

3．2．5 合成肽抑菌

3．2．6 类似肽的抑菌

3．3 结果与分析

3．3．1 离子交换柱层析

3．3．2 分子筛柱分离

3．3．3 反相高效液相C18柱分离

3．3．4 LC-ESI-MS联用分析

3．3．5 合成肽抑菌

3．3．6 类似肽的抑菌活性检测

3．4 本章小结

第四章 HAHp-葡萄糖美拉德产物对小鼠免疫功能的影响

4．1 材料与方法

4．1．1 材料

4．1．2 测定指标与方法

4．2 结果与分析

4．2．2 HAHp-葡萄糖美拉德产物对小鼠肝脏及血清生化指标影响

4．3 本章小结

结论

参考文献

致谢

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摘要

黄鲫鱼(Setipinna taty)营养丰富，味美价廉。但由于黄鲫鱼体积小，不论是食用还是加工，利用率比较低。在前期研究中，以蛋白酶水解法制备的黄鲫蛋白抗菌肽具有很强的抑菌作用，但是鱼腥味较重。而后通过美拉德反应提高了黄鲫蛋白抗菌肽的风味性，同时发现黄鲫蛋白抗菌肽美拉德产物(HAHp-葡萄糖美拉德产物)具有较强的抑菌活性。因此，本论文在前期研究基础上，以HAHp-葡萄糖美拉德产物为研究对象，探究其抑菌机制和有效抑菌组分结构，并对其在免疫提高方面的应用进行探讨。主要研究包括:(1)HAHp-葡萄糖美拉德产物的抑菌机理;(21)HAHp-葡萄糖美拉德产物中抗菌肽组分的分离与鉴定;(3)HAHp-葡萄糖美拉德产物对小鼠免疫功能的影响。　　HAHp-葡萄糖美拉德产物与处于对数生长期的大肠杆菌菌悬液作用，通过扫描电镜-观察菌体超微结构变化，结合外膜和内膜检测，分析胞内各种酶的释放情况，同时采用马尔文电位仪测定人工脂质体与HAHp-葡萄糖美拉德产物作用后粒径变化。结果表明:HAHp-葡萄糖美拉德产物与大肠杆菌作用1h即可造成细胞膜损伤;与大肠杆菌作用1h，外膜和内膜的渗透性增强;作用5h胞内乳酸脱氢酶释放量增加，大肠杆菌的ATP含量也显著降低。人工脂膜与黄鲫蛋白肽美拉德产物作用后，平均粒径从170 nm增加到230 nm，说明HAHp-葡萄糖美拉德产物对细胞膜具有聚集作用。由上述实验结果推断HAHp-葡萄糖美拉德产物可通过吸附作用达到菌体表面，引起菌体聚集，而后通过膜损伤方式增加外膜和内膜渗透性，造成胞内物质外泄，从而达到抑菌作用。　　采用离子交换层析、分子筛分离和反相高效液相色谱分离技术，通过抑菌活性跟踪检测法从HAHp-葡萄糖美拉德产物中分离得到一抑菌组分。然后，采用LC-ESI-MS联用分析法分离鉴定出7条抗菌肽，分别是RVAPEEHPTL、WLPVVR、 FFTQATDLLSR、 VLLLWR、 VLLVLLR、 VLLALWR和LLSWYDNEFGYSNR。化学合成其中5条肽(肽1 RVAPEEHPTL，肽2WLPVVR，肽3 VLLLWR，肽4 VLLVLLR和肽5 VLLALWR)，抑菌结果显示除了肽4外，其余4条合成肽对大肠杆菌均有抑菌活性。进一步选择肽2(WLPVVR)为出发肽，合成3条类似肽2-1(WLPVVH)、肽2-2(WLPVVE)和肽2-3(LPVVR)，抑菌结果表明合成的类似肽虽然保留了抑菌作用，但抑菌活性发生不同程度改变，说明肽序列组成对其抑菌性有影响。　　以昆明种小鼠为对象，通过小鼠动物实验，测定小鼠胸腺指数和脾脏指数，同时测定小鼠血清和肝匀浆谷胱甘肽过氧化物酶、总超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活力，以及测定脂质过氧化物含量和还原型谷胱甘肽含量。结果表明:HAHp-葡萄糖美拉德产物对胸腺指数以及脾脏指数的影响较小，与对照组相比，差异不显著。高剂量的HAHp-葡萄糖美拉德产物对小鼠肝脏与血清中谷胱甘肽过氧化物酶活力值增加有一定的帮助。高剂量组小鼠肝脏中总超氧化物酶活力也有所提高。HAHp-葡萄糖美拉德产物对于降低小鼠体内脂质过氧化物含量与提高还原型谷胱甘肽含量效果极为明显。从各个指标测定结果看，HAHp-葡萄糖美拉德产物可以提高小鼠体内抗氧化能力。

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