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重组人源甲胎蛋白在毕赤酵母中的高效表达及纯化

         
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摘要

Objective To realize the recombination clone ,heterologic high‐efficiency expression and protein purification of human‐source alpha‐fetoprotein(AFP)and to obtain the high purity of AFP with clinical bioactivity by the pPICZaA pichia expression systems .Methods The human recombinant expression plasmid pPICZαA‐AFP was generated by PCR from pReceiver‐AFP ,which AFP sequence was in accordance with GenBank .The AFP protein was expressed by methanol induction in pichia GS115 ,and purified by ammonium sulfate precipitation .The expression and purification of AFP was evaluated by SDS‐PAGE ,western blotting and HPLC ,and the value of AFP was quantified by chemiluminescence immunoassay in clinical hospital .Results Recombinant human AFP expressed in the pichia GS115 was mainly secreted into the extracellular medium supernatant ,and also contained the immunogenicity .87% of AFP was in 55% ammonium sulfate precipitate after ammonium sulfate fractionation ,which purity was 98 .844% and value was 3 .473 ng/mL .Recombinant human AFP showed the same size of the protein molecular weight as the clini‐cal hepatocellular carcinoma(HCC)serum samples ,indicating that the glycosylation level of recombinant AFP was comparable with clinical samples .Conclusion The high purified recombinant human‐resouce AFP with biological ac‐tivity could be used to prepare AFP reference materials ,traceable calibrator ,controls and related diagnostic reagents by Pichia expression system ,which could be used for clinical tumor diagnosis and therapeutic detection .%目的：从毕赤酵母GS115蛋白表达体系入手，实现人源甲胎蛋白（AFP）的重组克隆、异源高效表达、蛋白纯化并得到具有临床免疫原性的高纯度AFP。方法通过聚合酶链反应（PCR）从重组质粒pReceiver‐AFP扩增到目的基因片段，构建酵母重组表达质pPICZαA‐AFP，经测序比对与GenBank公开的AFP序列一致。将重组质粒pPICZαA‐AFP转入毕赤酵母GS115，通过甲醇诱导表达目的蛋白AFP。收集蛋白后用硫酸铵分级沉淀法对AFP进行纯化，高效液相色谱法（HPLC）检测纯度，在临床医院通过电化学发光法对其蛋白含量定值。结果研究发现AFP在酵母GS115中经甲醇诱导表达主要分泌到胞外培养基上清，免疫印迹试验能够检测到AFP蛋白条带，经硫酸铵分级沉淀，87％AFP目的蛋白存在于55％硫酸铵沉淀集份，HPLC检测其纯度为98．844％，电化学发光法检测其水平为3473ng／mL。最后与临床肝癌患者血清标本比对，蛋白的相对分子质量大小一致，表明其糖基化水平与临床标本相当。结论通过毕赤酵母甲醇诱导表达系统可以制备高纯度的、具有生物活性的、可用于肿瘤临床检测的AFP标准物质及其可以溯源的校准品、质控品和相关诊断试剂。

著录项

  • 来源
    《检验医学与临床》 |2014年第22期|3094-3096|共3页
  • 作者

    严子琴; 丁先锋; 胡卫江; 欧文斌; 刘丽; 刘俊; 施思; 李海龙; 蒋哲; 孟凡国; 周海梦; 徐蓓;

  • 作者单位

    浙江清华长三角研究院/浙江省应用酶学重点实验室/生物分析技术实验室;

    浙江嘉兴 314006;

    浙江理工大学生命科学学院;

    浙江杭州 310018;

    浙江清华长三角研究院/浙江省应用酶学重点实验室/生物分析技术实验室;

    浙江嘉兴 314006;

    浙江清华长三角研究院/浙江省应用酶学重点实验室/生物分析技术实验室;

    浙江嘉兴 314006;

    浙江清华长三角研究院/浙江省应用酶学重点实验室/生物分析技术实验室;

    浙江嘉兴 314006;

    浙江清华长三角研究院/浙江省应用酶学重点实验室/生物分析技术实验室;

    浙江嘉兴 314006;

    浙江清华长三角研究院/浙江省应用酶学重点实验室/生物分析技术实验室;

    浙江嘉兴 314006;

    浙江清华长三角研究院/浙江省应用酶学重点实验室/生物分析技术实验室;

    浙江嘉兴 314006;

    浙江清华长三角研究院/浙江省应用酶学重点实验室/生物分析技术实验室;

    浙江嘉兴 314006;

    浙江清华长三角研究院/浙江省应用酶学重点实验室/生物分析技术实验室;

    浙江嘉兴 314006;

    浙江清华长三角研究院/浙江省应用酶学重点实验室/生物分析技术实验室;

    浙江嘉兴 314006;

    中国计量科学研究院;

    北京 100013;

  • 原文格式 PDF
  • 正文语种 chi
  • 中图分类
  • 关键词

    甲胎蛋白; 毕赤酵母; 蛋白表达; 蛋白纯化;

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