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橡胶草法尼基焦磷酸合酶基因的克隆与功能分析

         
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[目的]法尼基焦磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthase,FPS)是天然橡胶生物合成的甲羟戊酸途径中的关键酶,获得橡胶草FPS基因并转化野生橡胶草,为研究FPS基因在橡胶草橡胶生物合成过程中的调控作用奠定基础.[方法]采用同源克隆的方法获得橡胶草FPS基因全长cDNA序列,并对该基因进行生物信息学分析.对橡胶草和其他18种不同高等植物的FPS氨基酸序列进行多序列比对及进化树分析.提取橡胶草不同组织:根、叶柄、叶、花梗、花和种子RNA,对FPS基因进行组织特异性表达分析,并对不同生长时期的橡胶草FPS表达量进行比较,分析橡胶草生长过程中FPS的调节作用.将该基因在野生型橡胶草中过表达,对得到的转基因和野生型植株FPS相对表达水平进行分析,比较转基因和野生型植株橡胶含量的变化.碱煮法提取转基因和野生型橡胶草根部的橡胶,测定橡胶含量.[结果]获得橡胶草FPS基因全长cDNA序列,命名为TKFPS(GenBank 登录号 KJ558350.1).序列分析表明该基因包含1个1 029 bp的完整开放阅读框,编码342个氨基酸,编码的蛋白质相对分子量为39.35 kD,理论等电点(pI)为5.41,平均疏水性为-0.242.多序列比对结果表明,橡胶草FPS氨基酸序列含有高等植物FPS基因的5个保守结构域,系统发育分析结果显示新疆野生橡胶草与蒲公英处于同一分支,其亲 关系最近.TMHMM和TargetP 亚细胞定位分析得知,TKFPS蛋白无跨膜区域,可能定位于细胞质中发挥功能.组织特异性分析结果表明TKFPS在橡胶草的根、叶柄、叶、花梗、花、种子中均有表达,其中,在叶中表达量最高,根次之,在花中表达量最低.重组子pCAMBIA2300-35S-TKFPS经农杆菌介导法转化野生橡胶草叶盘,得到6株转基因植株.实时荧光定量PCR检测发现,与野生型相比,转基因株系FPS的相对表达量水平明显升高,6株转基因株系TKFPS表达量平均约是野生型的2.8倍.橡胶含量测定结果表明6株转基因株系的根中橡胶质量分数平均比野生型增加了3.92％.[结论]成功从橡胶草中克隆获得TKFPS,并转化野生橡胶草得到转TKFPS的高产橡胶草株系,FPS在橡胶草产胶过程中发挥重要功能.

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