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玉米象线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅲ基因克隆与表达分析

         

摘要

[目的]克隆辣根素可能的作用位点——细胞色素C氧化酶亚基Ⅲ (COX Ⅲ)的全长cDNA,并对其进行序列分析及原核表达.[方法]在NCBI数据库中查找玉米象(Sitophilus zeamais)COX Ⅲ已知的部分序列,利用RT-PCR,结合RACE技术克隆获得玉米象COXⅢ全长序列;利用DNAMAN8.0、MEGA5.1、GENEDOC、ProtParam和TargetP 1.1 Server等软件对该基因全长cDNA序列、系统进化关系、基本理化性质及其三维结构进行分析;将玉米象COX Ⅲ基因分别与载体pEASY-Blunt E1、pET28a、pET30a、pET32a、pET42a连接,构建原核表达载体pEASY-Blunt E1-COXⅢ、pET28a-COXⅢ、pET30a-COXⅢ、pET32a-COXⅢ、pET42a-COXⅢ并分别转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中,在不同IPTG诱导浓度、温度以及时间内诱导融合蛋白表达,采用SDS-PAGE和Western blot(wB)对表达结果进行验证.[结果]获得的玉米象COXⅢ基因全长cDNA序列开放阅读框(ORF)为792 bp,编码263个氨基酸,编码的蛋白分子质量约为30 938.1Da,理论等电点pI 6.51,预测分子式为C1492H2154N338O362S10,不稳定系数为34.49,总平均亲水系数为0.492,为疏水的稳定蛋白.系统发育树显示玉米象与鞘翅目象鼻虫科昆虫米象进化关系最近.原核表达结果表明,该蛋白在1 8℃、1 mmol·L-1 IPTG诱导24 h的条件下即能实现融合蛋白的表达,可溶性检测表明该蛋白主要以包涵体的形式存在;Western blot印迹检测证实大肠杆菌BL21 (DE3)中表达了一个分子量约为62 kD的融合蛋白.[结论]成功从玉米象昆虫克隆得到COXⅢ全长cDNA序列,并实现了其编码蛋白的原核表达,可为后续探究玉米象COXⅢ功能和异硫氰酸酯类化合物对玉米象的作用机理提供理论依据.

著录项

  • 来源
    《中国农业科学》 |2016年第23期|4544-4554|共11页
  • 作者单位

    西北农林科技大学无公害农药研究服务中心;

    陕西杨凌712100;

    西北农林科技大学无公害农药研究服务中心;

    陕西杨凌712100;

    西北农林科技大学无公害农药研究服务中心;

    陕西杨凌712100;

    陕西省生物农药工程技术研究中心;

    陕西杨凌712100;

    西北农林科技大学无公害农药研究服务中心;

    陕西杨凌712100;

    陕西省生物农药工程技术研究中心;

    陕西杨凌712100;

    西北农林科技大学无公害农药研究服务中心;

    陕西杨凌712100;

    陕西省生物农药工程技术研究中心;

    陕西杨凌712100;

    西北农林科技大学无公害农药研究服务中心;

    陕西杨凌712100;

    陕西省生物农药工程技术研究中心;

    陕西杨凌712100;

    西北农林科技大学无公害农药研究服务中心;

    陕西杨凌712100;

    陕西省生物农药工程技术研究中心;

    陕西杨凌712100;

  • 原文格式 PDF
  • 正文语种 chi
  • 中图分类
  • 关键词

    玉米象; 细胞色素C氧化酶亚基Ⅲ; RACE技术; 生物信息学; 原核表达;

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