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【2h】

Design of Trypanosoma rangeli sialidase mutants with improved trans-sialidase activity

机译：具有改良反唾液酸酶活性的锥虫锥虫唾液酸酶突变体的设计

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A sialidase (EC 3.2.1.18) from the non-pathogenic Trypanosoma rangeli, TrSA, has been shown to exert trans-sialidase activity after mutation of five specific amino acids in the active site (M96V, A98P, S120Y, G249Y, Q284P) to form the so-called TrSA5mut enzyme. By computational and hypothesis driven approaches additional mutations enhancing the trans-sialidase activity have been suggested. In the present work, we made a systematic combination of these mutations leading to seven new variants of the T. rangeli sialidase, having 6–16 targeted amino acid mutations. The resulting enzyme variants were analyzed via kinetics for their ability to carry out trans-sialidase reaction using CGMP and D-lactose as substrates. The sialidase variants with 15 and 16 mutations, respectively, exhibited significantly improved trans-sialidase activity for D-lactose sialylation. Our results corroborate, that computational studies of trans-glycosylation can be a valuable input in the design of novel trans-glycosidases, but also highlight the importance of experimental validation in order to assess the performance. In conclusion, two of the seven mutants displayed a dramatic switch in specificity from hydrolysis towards trans-sialylation and constitute the most potent trans-sialidase mutants of TrSA described in literature to date.
机译：已经证明，非致病性锥虫TrSA的唾液酸酶（EC 3.2.1.18）在活性位点（M96V，A98P，S120Y，G249Y，Q284P）中的五个特定氨基酸突变为形成所谓的TrSA5mut酶。通过计算和假设驱动的方法，已经提出了增强反唾液酸酶活性的其他突变。在目前的工作中，我们对这些突变进行了系统的组合，从而产生了7个新的兰氏锥虫唾液酸酶变体，这些变体具有6至16个目标氨基酸突变。通过动力学分析所得的酶变体，以CGMP和D-乳糖为底物进行反唾液酸酶反应的能力。分别具有15和16个突变的唾液酸酶变体对D-乳糖唾液酸化表现出明显提高的反唾液酸酶活性。我们的研究结果证实，反式糖基化的计算研究可以为新型反式糖苷酶的设计提供有价值的信息，但也突出了为了验证性能而进行实验验证的重要性。总之，七个突变体中的两个显示出从水解到反唾液酸化的特异性急剧变化，并且构成了迄今为止文献中描述的最有效的TrSA反式唾液酸酶突变体。

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