盐酸青藤碱在治疗男性抗精子抗体阳性免疫不育中的应用

技术领域

本发明涉及一种治疗男性抗精子免疫不育的新药物，属于生物医药领域的发明。 

背景技术

男性不育的原因非常复杂，其中抗精子免疫性因素是非常重要的方面【林宝英. 抗精子抗体与免疫性不育[J].皖南医学院学报，2004,23（1）：71～73；[2]万霞.免疫性不育与抗精子抗体，实用医技杂志，2007，14（21）：2926—2927】。一项关于男性不育症病因的研究发现，抗精子免疫性不育高达29.9%【向桂桥,陈荣安,张益康,等.6498例男性不育症病因分析[J].南华大学学报:医学版,2005,33(2):211-223】。抗精子抗体（AsAb）介导的免疫性不育已证实为男性不育的重要原因之一。目前，WHO已把免疫性因素列为男性不育常规检查的项目。 

男性抗精子免疫性不育是指以精子作为抗原，在体内激发免疫反应所引起的不育。正常情况下，由于生殖免疫屏障的存在，机体不会对自身精子产生免疫反应。但在病理状态下，由于血睾屏障的破坏，就会造成精子或其可溶性抗原成分的逸出，诱发机体产生抗精子抗体（AsAb）。AsAb可对体内精子产生细胞毒作用，影响精子受精过程和受精卵及胚胎的发育，造成生殖障碍。泌尿生殖道的感染和阻塞等因素有可能与抗精子抗体产生有关。抗精子抗体导致男性不育的机理十分复杂，可在抵制和降低精子获能、顶体反应穿越透明带和精卵融合、受精卵甚至胚胎发育等多个环节上影响生育。抗体引起的精子制动、精子凝集，精子的运动能力下降等，都有可能使其不能达到女性生殖道的受精地点。此外，AsAb所具有的细胞毒效应，在补体的参与下，也可造成精子死亡或失去活力。精浆的中TNF-α、IL-6、IL-2的过度表达也不同程度参与了发病。 

目前，对男性抗精子免疫性不育的治疗尚缺乏高效特异的方法。现有的治疗首先是去除病因,其次是降低患者体内的抗精子抗体的滴度。现代医学药物治疗主要是类固醇激素【江海身.男性不育的诊断与治疗. 中国性科学,2007,16(7):18-21】。其他如采用免疫阻断和辅助生育技术。 辅助生育技术因条件所限，一般难以广泛推广。而激素类药物的毒副作用和可能存在的其他风险，使得其临床应用非常谨慎。近年来，国内学者在采用中医药或中西医结合的方法治疗该病方面取得了一定的成绩。但目前有关中药在这方面的研究缺乏系统性，尤其是作用机理不清楚。 

盐酸青藤碱，是从中药青风藤[防已科植物青藤sinomenium acutum(Thumb)Rehd.et Wils毛青藤sinomenium acutum(thumb) Rehd.et Wils. Var cinereum Rehd. Et Wils的茎或根茎]中提取的青藤碱的盐酸盐。研究证实，盐酸青藤碱具有显著的免疫抑制作用，和抗炎、镇痛作用。目前由该成分制成的口服片剂和注射液在临床使用。商品名为“正清风痛宁”的系列产品即为由盐酸青藤碱制成的系列药品制剂，目前，该类制剂批准用途为治疗类风湿性关节炎、强直性脊椎炎、慢性肾炎等疾病，有非常确切的疗效，近年来，对盐酸青藤碱抗炎、免疫作用机理的研究不断深入，但是，尚未见到有盐酸青藤碱治疗男性抗精子免疫不育的研究报道，本专利的申请，是关于首次发现盐酸青藤碱抗精子免疫免疫不育治疗作用新用途的研究结果。 

本发明的目的是提供一种治疗男性抗精子抗体阳性免疫性不育的新药剂，为男性抗精子抗体阳性免疫性不育的临床治疗开辟新的治疗途径。 

发明内容

一、本发明的技术方案为：

        第一步：明确盐酸青藤碱的来源及确定已有盐酸青藤碱制剂作为药品在临床应用。

每二步：研究证实盐酸青藤碱对抗精子阳性免疫不育的治疗作用并分析其作用机制，包括： 

1：模拟制备男性抗精子免疫性不育的动物模型

2：对模型动物采用盐酸青藤碱进行治疗，并设阳性对照与空白对照。

3：考察治疗药物对模型动物生殖力的影响，将治疗后雄鼠与雌鼠合笼交配，通过观察所交配雌鼠的妊娠率与胚胎数与发育情况，考察盐酸青藤碱对免疫性不育动物模型生殖力的影响。 

4：对盐酸青藤碱治疗男性抗精子免疫不育的作用机理进行分析。观察指标包括：经盐酸青藤碱治疗后模型动物血清和精浆中的抗精子抗体滴度、精子的数量和质量、与抗精子免疫相关的细胞因子、及生精组织与细胞的形态学。 

二、本发明的有益效果为：

1.免疫性不育模型动物经盐酸青藤碱治疗后生育力较模型对照明显增强，所交配雌鼠的受孕率提高、胚胎数增加，且胚胎发育正常。 

2．盐酸青藤碱显著降低抗精子免疫不育雄性大鼠血清中的抗精子抗体水平，剂量增加后作用增强，与模型组比较有统计学差异。 

3．盐酸青藤碱能对抗与精子免疫相关的部分细胞因子表达。降低精浆中的肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素2（IL-2）的含量，与模型组比较有统计学意义。 

4．盐酸青藤碱可改善抗精子免疫不育大鼠的精子数量和质量，使精子数量增加、精子的活率和活力均明显提高，与模型组比较有统计学意义。 

5．睾丸组织病理学检查证实，盐酸青藤碱可改善抗精子抗体阳性大鼠睾丸组织中治疗后的动物较对照组的成熟精子增多。 

三、本发明的具体实施方式为：

对盐酸青藤碱来源及制剂产品的研究

盐酸青藤碱是从中药青风藤【防已科植物青藤sinomenium acutum(Thumb)Rehd.et Wils或毛青藤sinomenium acutum(thumb)Rehd.et Wils. Var cinereum Rehd. Et Wils的茎或根茎】中提取的生物碱单体——青藤碱，再制备成可供药用的盐酸盐，目前，已有获得国家药品监督管理局批准生产的盐酸青藤碱制剂在临床使用，目前常见的片剂、缓释剂和注射液均有此作用。

青藤碱来源的原植物

青藤碱是从中药青风藤【防已科植物青藤sinomenium acutum(Thumb)Rehd.et Wils或毛青藤sinomenium acutum(thumb)Rehd.et Wils. Var cinereum Rehd. Et Wils的茎或根茎】中提取的生物碱单体。

青藤Sinomenium acutum (Thun b.)Rehd. Et Wils。为落叶缠绕藤本。茎带木质，枝绿色，叶互生，花小，单性，雌雄异株；种子半月形。药用其干燥藤茎部分。藤茎呈细长圆柱形，直径5～20毫米，外表灰褐色，有纵皱及横向皮孔，节处膨大。 体轻，质坚实而脆，易折断，断面灰黄色或淡灰棕色，不平坦。横切面韧皮部很窄，木质部导管与射线呈放射状排列，导管较大，中央为圆形的髓。气弱，味苦。 

毛青藤sinomenium acutum(thumb)Rehd.et Wils. Var cinereum Rehd. Et Wils，外表特征与青藤相似，维管束数稍多。 

青藤碱的提取工艺

是从青风藤中提取青藤碱已经有了比较成熟工艺，回流提取和超声提取的方法为目前常用的提取工艺。

（一）回流提取法  

采用回流提取法提取青藤碱时，优选出青风藤中青藤碱最佳提取工艺为：用8倍量70％乙醇，回流提取2次，每次1.5h，该提取工艺还可进一步优化为：以7.5%～10%的熟石灰、1.8倍量水进行碱化，用1.5倍量工业苯回流提取。产品经紫外分光光度法测定，青藤碱含量大于95％。

（二）超声提取法  

以苯为溶剂，采用超声法也可从青风藤中提取青藤碱。超声提取物经活性炭脱色和重结晶得到青藤碱，青藤碱的产率为2．12％，含量为98．73％。使用超声提取分离青藤碱不影响其分子结构、操作简便，所得产品的含量与回流提取法基本相近，但高效液相色谱检测时，杂质峰较回流提取法多。

、青藤碱的理化性质

  青藤碱由氢菲核及乙胺桥组成，类似吗啡，分子式C₁₉H₂₃NO₄,分子质量329.39Da，其性状为长丝状晶体，熔点161℃，熔化后熔点又升至182℃，易溶于氯仿、丙酮、乙醇和碱液中，微溶于水、乙醚和苯，较难溶于乙酸乙酯中，其盐酸溶液加三氯化铁呈草绿色，盐酸盐为长针状晶体，熔点233℃，易溶于水

青藤碱的化学结构式

（二）．对盐酸青藤碱治疗男性抗精子免疫不育治疗作用的研究

1.实验材料

1.1实验动物

SPF级SD性成熟大鼠，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，体重：180～220g。

实验药物

1.2.1受试药物

     盐酸青藤碱片（商品名：正清风痛宁片）。国药准字号：Z43020278。由湖南正清制药集团股份有限公司生产，批号：1001109，规格：24片/盒，每片含20mg盐酸青藤碱。

1.2.2阳性对照药物 

    醋酸泼尼松片（强的松片）：国药准字号：H33021207，由浙江仙琚制药股份有限公司生产，批号：100875，规格：5mg/片。

实验试剂

M199培养液：赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司；

Freund完全佐剂：美国Sigma公司；

大鼠抗精子抗体(AsAb) 、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-2（IL-2）肿瘤坏死因子α（TNF-α）酶联免疫试剂盒均由长沙力生试剂公司提供。

主要实验仪器

岛津UV-1750紫外可见分光度计（岛津仪器公司）；RT-6000全自动酶标仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司）；

Reichert Histo STAT 820型切片机为美国生产，MOTIC BISERLES型显微摄影系统为麦克奥迪（厦门）医疗诊断系统有限公司产品。

实验方案

2.1 抗精子抗体阳性免疫不育大鼠模型的建立

模型的制备参照文献【[1]：张淑芹,温海霞,赵林山,等.抗精子阳性大鼠动物模型的建立[J].中国比较医学杂志,2003,13(6):370-373；[2]：张玮,张辉,边淑玲,等.NO对抗精子抗体阳性大鼠精予凋亡的影响[J].中国男科学杂志,2003,17(6):384-386】方法并加以改进，采用人工主动免疫法造模，共免疫三次，在第三次免疫后于大鼠眼眶采血，分离血清，用酶联免疫法检测血清的抗精子抗体（AsAb）滴度，与正常对照动物比较应有明显增加，具体过程如下：

2.1.1制备大鼠佐剂性精子抗原

取性成熟雄性大鼠若干只，用颈椎脱臼法处死，立即取出双侧附睾，在灭菌纸上除去血液和脂肪组织，然后在2ml生理盐水中剪碎附睾， 37℃静置10min，使精子充分游出，用孔径200μm尼龙网过滤，滤液置37℃培育20min后用血球计数板调精子数为3×10⁹/ml，与等量完全弗氏佐剂混匀，在乳钵中充分研磨，直至呈“油包水”状，即为精子的免疫性抗原。

同种异体注射佐剂性精子抗原制备抗精子抗体阳性大鼠模型

取性成熟雄性大鼠（体质理180—220g），除正常对照组外，其余各鼠均以制备的上述精子抗原0.5ml，在双侧腹股沟及颈背部脊柱两侧皮下多点注射作为首次抗原免疫，分别采用了于首次免疫后的第10天在原部位1次注射免疫攻击、和在首次免疫后的第10天和第20天，在原部位2次注射免疫攻击的方法进行模型制备，正常组给予0.5ml生理盐水注射作为对照，在免疫攻击完成后第7天，采血检测血清中的抗精子抗体（AsAb）滴度，检测方法采用酶联免疫分析法，具体操作按试剂盒要求，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中大鼠抗精子抗体(AsAb)浓度。

结果，用精子与弗氏佐剂制备的佐剂免疫抗原进行攻击，2次免疫攻击与1次攻击比较，大鼠经2次免疫攻击后，血清中抗精子抗体滴度升高更显著，见表1，表明制备抗精子抗体阳性免疫不育模型，采用同种异体精子抗原2次免疫注射攻击更为可靠。 

表1.同种异体精子抗原不同免疫攻击次数的大鼠血清AsAb检测结果 

注：△：与正常组比较P＜0.05，△△：与正常组比较P＜0.01; 

 2.3 研究内容及结果

2.3.1盐酸青藤碱对雄性抗精子抗体阳性模型大鼠生殖力的影响

2.3.1.1制备雄性抗精子抗体阳性大鼠模型及分组与给药

取性成熟雄性大鼠，体重180—220g，如上所述方法，采用1次免疫注射、2次免疫攻击的方法注射同种异体佐剂性精子抗原制备抗精子抗体阳性大鼠模型。

将造模动物分为模型对照组、阳性药物对照组、及盐酸青藤碱高、低2个剂量组，模型对照组和正常对照组给予等体积蒸馏水，其余3组药物组分别给予相应药物，每天1次上午灌胃给药，连续给药4周。给药结束后分别与雌鼠合笼交配。 

与雌鼠交配方法与观察指标

各组雄鼠按1:2与正常雌鼠合笼交配。合笼后每日观察雌鼠有无阴栓形成，以发现阴栓为妊娠龄第1d，计算各组的妊娠率。妊娠第16天，用颈椎脱臼法处死雌鼠，解剖所配对的雌鼠，分离子宫，.观察胚胎情况，记录胚胎数，观察各胎仔发育情况，考察治疗后的雄鼠雌鼠交配后的妊娠结果。

实验结果

未经治疗的抗精子抗体阳性模型雄性大鼠所交配的雌鼠受孕率较低，仅有52.63%。各孕鼠的胚胎数较少，均较与正常大鼠交配者明显减少，强的松和盐酸青藤碱治疗后的雄鼠所交配的雌鼠受孕率较模型组明显提高，60和120mg/kg剂量时分别为61.11%和72.22%；各孕鼠的胚胎数也较模型组更多，表明盐酸青藤碱可提高抗精子抗体阳性大鼠的生殖力，强的松阳性对照组与模型组比较也有，见表2。

表2.  盐酸青藤碱治疗后所交配雌鼠的妊娠结果（±SD）

注：△：与正常组比较P＜0.05，△△：与正常组比较P＜0.01; ★：与模型组比较P＜0.05, ★★：与模型组比较P＜0.01.

2.3.2盐酸青藤碱对雄性抗精子抗体阳性模型抗体生成及相关免疫细胞因子影响的研究

2.3.2.1模型制备及分组与给药

方法同2.3.1.1、2.3.1.2

2.3.2.2 实验结果

2.3.2.2.1对血清抗精子抗体生成的影响

   与正常组大鼠相比，模型组大鼠抗精子抗体滴度明显提高，有显著性差异（P<0.01），表明模型成立。盐酸青藤碱剂量为120mg/kg时明显降低血清中的抗精子抗体滴度，与模型组比较有显著性差异（P<0.01）；阳性对照强的松与模型组比较也有显著性差异（P<0.01）。见表3.  

表3.盐酸青藤碱对抗精子抗体大鼠血清AsAb生成的影响（±SD）

注：△：与正常组比较P＜0.05，△△：与正常组比较P＜0.01; ★：与模型组比较P＜0.05, ★★：与模型组比较P＜0.01. 

2.3.2.2.2对精浆中与抗精子免疫相关的细胞因子的影响

模型组大鼠与正常组大鼠相比，精浆中TNF-α、IL-6、IL—2水平普遍升高值偏高，有显著性差异（P<0.01）; 盐酸青藤碱对精浆中的TNF-α、IL-6、IL—2的生成均不同程度的抑制作用，强的松阳性对照组与模型组比较也有显著性差异（P<0.05）。见表4。

表4. 盐酸青藤碱对抗精子抗体阳性大鼠精浆中免疫细胞因子的影响（±SD）

注：△：与正常组比较P＜0.05，△△：与正常组比较P＜0.01; ★：与模型组比较P＜0.05, ★★：与模型组比较P＜0.01.

2.3.3 盐酸青藤碱对抗精子抗体阳性大鼠精子数量与质量的影响

2.3.3.1 模型制备与分组、给药

方法同2.3.1.1、2.3.1.2

2.3.3.2实验结果

2.3.3.2.1 对大鼠精子数量与活精率的影响

给药结束后，取大鼠一侧附睾，用灭菌脱脂棉上除去血液和脂肪组织，在2ml 生理盐水中剪碎附睾， 37℃下静置20min，用200μm孔径尼龙网过滤得精子悬液。稀释后用血球计数板进行精子计数。取精子悬液滴于载玻片，加等量5g/L的伊红Y染液，混匀后加盖玻片，放置30s后在显微镜（高倍镜）下观察200个精子中不着色精子（活精子）和着红色精子（死精子）的比例，计算出活精率^[15]（活精率=活精子数/200）。

结果，经盐酸青藤碱及强的松治疗后的大鼠，精子数量和活精率均明显高于未经治疗的模型组，表5。 

表5.盐酸青藤碱对AsAb阳性大鼠精子数与活精率的影响（±SD）

  注：与正常组比较^▲P<0.05，^▲▲P<0.01；与模型组比较^★P<0.05，^★★P<0.01。

2.3.3.2.2 对大鼠精子活动率与活动力的影响

取精子悬液滴于载玻片，加盖玻片后在显微镜（高倍镜）下观察100个精子，计算其中活动精子所占的比例，计算出精子的活动率。

取精子悬液注入血球计数板中，高倍镜下，按WHO的精子活动力4级标准，对200个精子的活动力进行分析，计算各级活动力的精子数（附级别标准：a级：快速前向运动；b级：缓慢前向运动；c级：非前向运动；d级：不动）。 

结果，与正常组相比，模型组动物的精子活力明显下降，具有向前运动能力的精子数量减少，不定向运动及不动的精子数量增多，2种剂量的盐酸青藤碱均有提高精子活力的作用，向前运动的精子数（a+b级）增加，主要是b级精子数量明显增多，而不运动的d级精子数量则明显减少，均较模型对照组有显著差异，其结果与4.62mg/kg强的松的作用相似，见表5-6。 

表5.盐酸青藤碱对AsAb免疫不育大鼠精子活动率、活力程度的影响（±SD）

注：△：与正常组比较P＜0.05，△△：与正常组比较P＜0.01;★  ：与模型组比较P＜0.05, ★★：与模型组比较P＜0.01.下表同

表6. 盐酸青藤碱对AsAb免疫不育大鼠精子活动力的影响

2.3.4 盐酸青藤碱对抗精子抗体阳性大鼠睾丸生精细胞结构与形态的影响

2.3.4.1模型制备及分组给药

方法同2.3.1.1、2.3.1.2，给药结束后，取各鼠右侧睾丸用10%福尔马林固定，各标本均取相同部位组织，经乙醇逐级脱水、透明后进行浸蜡包埋，用Reichert Histo STAT 820型切片机切成5μm切片，采用HE染色。在麦克奥迪显微摄影系统（MOTic BISERLES型）下进行组织形态学观察。

实验结果

正常组实验大鼠睾丸精曲小管精原细胞，次级、初级精母细胞等结构清楚，层次分明，各级生精细胞发育良好，排列整齐，生精上皮规则圆形，排列紧密，精原细胞大而圆，规则地紧贴在曲细精管的基底膜，成熟精子多，间质细胞发育良好。

模型组精曲小管精原细胞结构尚清楚，次级，初级精母细胞结构欠清楚，排列不整齐，数量明显减少，曲细精管轻度萎缩，部分生精细胞核固缩、变性，发育成熟精子明显减少；间质水肿明显，部分间质细胞变性。 

盐酸青藤碱治疗组大鼠睾丸曲细精管结构良好，精子、精原细胞发育正常，成熟精子较多，间质水肿不明显。表明盐酸青藤碱可改善病理模型的睾丸组织损伤，强的松也能减轻造模所引起的大鼠睾丸组织病变。