一种对水产养殖环境沉积物中厌氧氨氧化细菌进行定量的方法

技术领域

本发明涉及一种对水产养殖环境沉积物中厌氧氨氧化细菌进行定量的方法，属于环境微 生物生态学技术领域。

背景技术

我国是第一水产养殖大国和水产品贸易大国，养殖水产品产量占全世界产量的70%。集 约化、高密度养殖规模日益扩大，集中投饵造成养殖水体中积累大量的粪便、残饵和死亡的 动植物尸体，导致水体中作为蛋白代谢终产物的氨氮和亚硝酸氮含量严重超标，养殖生态环 境遭到破坏，鱼虾病害频发，造成巨大的经济损失。同时，大量养殖含氮废水排放到沿海海 域，造成了严重的环境污染，引发附近海域富营养化现象。氨氮污染已成为制约水产养殖成 败和环境污染的主要胁迫因子，控制水体中的氨氮污染成为规模化养殖成功的关键之一。

氨氮的去除主要通过氨氧化作用进行，氨氧化微生物能够快速降解、吸收和转化水中的 氮素污染物，并在形成优势菌群后抑制有害微生物的生长，在养殖水体修复、自净中发挥关 键性作用。水产养殖环境的底泥（即沉积物）中有大量的微生物群落，它们参与氮、磷等多 种营养素的生物地球化学循环，它们与水体中的微生物快速交换，对维持沉积物和水体的生 态平衡有重要意义。长期以来，氨氧化被认为是一个好氧过程，由氨氧化细菌（AOB，ammonia oxidizing bacteria）和氨氧化古菌（AOA，ammonia oxidizing archaea）参与。最近的研究发现， 厌氧氨氧化（Anammox，anearobic ammonia oxidizing）过程能够在缺氧和厌氧条件下将氨氮 和亚硝酸氮转化为氮气，广泛分布与海洋、淡水、土壤等生态系统。在缺氧的海洋沉积物中， 厌氧氨氧化过程产生的氮气的比例占据到20-79%，是不可忽视的重要生物地球化学循环过 程。水产养殖环境经常处于缺氧状态，厌氧氨氧化过程不但能够去除氨氮，同时还能够解除 亚硝酸盐的毒性作用，对维持水产养殖环境中沉积物和水体的良好条件有重要意义。

厌氧氨氧化过程由隶属于浮霉菌门的厌氧氨氧化细菌执行。厌氧氨氧化细菌生长十分缓 慢（平均传代时间10-12天），且与其它微生物之间存在复杂的竞争和共生关系，至今在世界 范围内尚未得到厌氧氨氧化细菌的纯培养菌株。这极大地限制了传统的生理生化方法对厌氧 氨氧化细菌的研究，迫切需要一种新的方法对厌氧氨氧化细菌的存在、种群、数量和生态学 特点进行揭示。荧光定量PCR技术是最近发展出来的分子生物学手段，是在PCR技术的基 础上发展而来的一种体外定量手段，已广泛应用于微生物学研究，可以不依赖于纯培养手段 对微生物进行种类和数量的检测。

现有的厌氧氨氧化细菌的分子生物学研究多使用16S rRNA基因作为分子标识，如沈李 东，胡宝兰等人对西湖底泥中厌氧氨氧化菌进行的分子生物学检测（沈李东，胡宝兰，郑平， 钱轶超，陈婷婷，胡安辉，楼莉萍，《西湖底泥中厌氧氨氧化菌的分子生物学检测》，环境生 物学报，2011:31（8）：1609-1615）以及叶磊，祝贵兵等人对北京某污水处理厂的活性污泥进 行的分子生物学检测（叶磊，祝贵兵，伦中财，王朝旭，王衫允，冯晓娟，尹澄清，《应用分 子生物学与同位素示踪技术研究厌氧氨氧化菌活性及功效》，环境科学学报，31（6）： 1206-1211），上述检测都是针对厌氧氨氧化细菌16S rRNA基因设计了特异性引物。但是，16S rRNA引物存在特异性不强、覆盖率不够、多样性偏低、有非目的基因扩增等缺点，不能够 真实的反映环境中存在的厌氧氨氧化细菌的种类、多样性、分布和数量。本发明使用厌氧氨 氧化细菌的特征酶HZO基因作为分子标识，设计HZO基因特异性引物，利用实时荧光定量 PCR的方法对厌氧氨氧化细菌进行定量检测，能够克服已有技术的缺点，快速、灵敏、准确、 真实地对沉积物中厌氧氨氧化细菌进行数量检测。

发明内容

肼氧化还原酶HZO（Hydrazine oxydoreductase）负责催化厌氧氨氧化反应的关键步骤， 目前仅仅在厌氧氨氧化细菌这一类群中发现HZO酶的存在，是厌氧氨氧化细菌的特征酶。本 发明的发明人使用厌氧氨氧化细菌的特征酶HZO基因作为分子标识，设计HZO基因特异性 引物，利用荧光定量PCR的方法对厌氧氨氧化细菌进行定量检测，可以克服已有16S rRNA 基因测定特异性不高、多样性偏低、存在假阳性扩增的缺点，能够快速、灵敏、准确、真实 地对沉积物中厌氧氨氧化细菌进行数量检测。

本发明的目的是，克服厌氧氨氧化细菌无法纯化培养和16S rRNA基因定量不准确的缺 陷，使用对应厌氧氨氧化关键功能酶HZO基因的特异性引物，利用实时荧光定量PCR技术， 实现水产养殖沉积物中的厌氧氨氧化细菌快速、灵敏、准确、真实的定量研究。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案是，一种对水产养殖环境沉积物中厌氧氨氧化 细菌进行定量的方法，通过肼氧化还原酶HZO基因的荧光定量PCR反应，对厌氧氨氧化细 菌进行定量，步骤为：

（1）样品DNA的提取和定量

取沉积物样品，加入裂解液，在核酸提取仪中进行裂解，裂解后的样品冷冻离心取上清 液，调整盐离子浓度后加入硅胶颗粒，使DNA结合在硅胶颗粒上，结合DNA的硅胶颗粒悬 浮液转移入纯化柱，清洗去除蛋白质等杂质，最后用洗脱缓冲液洗脱结合在硅胶颗粒上的宏 基因组DNA，使用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检验DNA的浓度和纯度。用荧光定量仪测定宏基 因组DNA浓度；

（2）HZO基因标准质粒的制作

使用HZO基因特异性引物hzoF1和hzoR1对样品DNA进行PCR扩增，

PCR反应体系为：10×PCR Buffer1.25μl，2.5mM dNTP 1.00μl，25mM MgCl20.75μl，10μg/μl BSA 1.00μl，20μM上下游引物各0.25μl，沉积物总DNA 1.00μl，TaqDNA聚合酶2.5U，双 蒸水补足到25μl，

扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min30s，共 35个循环，最后72℃延伸10min，

合并多次反应得到的PCR产物，切胶回收后连接入pGMT-19Simple Vector载体中，转 化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，液体LB培养基过夜培养，提取质粒，测定浓度后将质粒 10倍浓度梯度稀释，制作标准品，用荧光定量仪测定质粒浓度，计算基因拷贝数；

（3）荧光定量PCR扩增

调整所有样品DNA的浓度至10μg/μl，对标准质粒和样品在同一批次进行荧光定量PCR 扩增。

反应体系包括：2×SYBR Green Premix 7.5μl，10μM上下游引物各0.3μl，50×ROX Reference Dye II 0.3μl，模板DNA1.0μl，双蒸水补足到总体积12.5μl，

PCR反应程序为：95℃预变性2min，95℃变性5s，55℃退火20s，72℃延伸30s，80℃ 延伸40s，循环40次，80℃读取荧光值，并加熔解曲线检测产物特异性；

（4）沉积物样品厌氧氨氧化细菌数量计算

根据标准质粒的初始拷贝数的对数值和Ct值制作标准曲线，得到回归曲线和公式，根据 定量PCR反应得到的样品Ct值，计算出HZO基因的拷贝数。

本发明的创新点和有益效果：

（1）现有技术中的研究主要是关注好氧氨氧化过程，而水产养殖沉积物中往往是缺氧甚 至局部厌氧的，本发明首次建立了对水产养殖环境厌氧条件下氨氧化微生物的定量研究；

（2）本发明克服了厌氧氨氧化细菌难以进行分离培养的缺点，建立了一种利用分子生物 学手段对厌氧氨氧化细菌进行荧光定量研究的方法；

（3）现有技术中使用16S rRNA基因作为分子标识的荧光定量PCR方法，存在特异性不 强、覆盖率不够、多样性偏低、有非目的基因扩增等缺点，不能够真实的反映环境中存在的 厌氧氨氧化细菌的种类、多样性、分布和数量，本发明使用厌氧氨氧化细菌的特征酶HZO基 因作为分子标识，能够快速、灵敏、准确、真实的对沉积物中厌氧氨氧化细菌进行数量检测， 并且由于对应厌氧氨氧化过程的关键功能基因，能够建立细菌数量与厌氧氨氧化活性之间的 相关关系；

（4）本发明将所有样品DNA统一调整浓度，降低了不同样品之间存在的腐殖质等PCR 抑制物对PCR反应的干扰，得到的标准曲线斜率为-3.02，回归系数大于0.99，体现了良好的 扩增效率和回归关系。

附图说明

图1为厌氧氨氧化细菌荧光定量PCR标准曲线；

图2为厌氧氨氧化细菌荧光定量PCR熔解曲线。

具体实施方式

1、DNA的提取和定量

采集水产养殖环境沉积物样品后，迅速混匀，立刻放入干冰中，转移到-80°C冰箱保存。 使用MP Biomedicals公司的Fast Prep-24核酸提取仪及土壤DNA快速提取试剂盒（FastDNA Spin kit for soil）进行沉积物DNA的提取。操作方法如下：向Lysing MatrixZ管中加入0.3g 沉积物样品（勿超0.3g），加入1100μl裂解液。将上述离心管放入FastPrep-24核酸提取仪中， 设定速度5，离心时间40s。将上述离心管在4℃条件下14000×g离心10min。小心将上清移 入新的1.5ml离心管中加入250μlPPS，并轻柔颠倒10次将其混匀。将上述混合液以14000×g 4℃离心5min，将上清移入新的离心管中，将Binding Matrix Suspension摇匀，悬浮，向上述 上清中加入500μl的Binding Matrix Suspension。用手轻柔颠倒混匀2min，将管放置于管架上 静置3min。管吸出600μl上清丢弃，使余下的上清与Binding Matrix混匀，将混合液移入纯 化柱（spin fillter）中14000×g离心1min，倒掉收集管中的废液。向纯化柱中加入500μl已加 入乙醇的SEWS-M，14000×g离心1min，倒掉收集管中的废液，以14000×g离心2min。将纯 化柱移入新的收集管中，室温下空气中干燥纯化柱5min。加入50μl DES，并且用枪头清搅滤 膜或用手指轻弹使DNA溶解，静置1min（55℃水浴5min），以14000×g离心1min，使DNA 转移到收集管中。再加40μl重复以上步骤。使用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测提取的总DNA质 量。保存于-80℃冰箱。使用Modulus公司的荧光定量仪测定DNA的浓度。

2、标准质粒的构建和

使用厌氧氨氧化细菌的特征酶肼氧化还原酶HZO的保守序列设计引物对沉积物宏基因 组DNA进行PCR扩增。上游引物为hzoF1：5’-TGTGCATGGTCAATTGAAAG-3’，下游引 物为hzoR1：5’-CAACCTCTTCWGCAGGTGCATG-3’。PCR反应在0.2ml薄壁管中进行，总 体积为25μl，使用Fermentas的Taq DNA聚合酶进行PCR扩增，扩增体系包含以下成分（见 表1）：

表1PCR扩增体系

PCR扩增程序为：94°C预变性5min，94°C变性1min，55°C退火1min，72°C延伸1min30s， 共35个循环，最后72°C延伸10min。为保证产物的量，共进行10-20个25μl体积的PCR扩 增反应，用1%琼脂糖凝胶电泳检测反应产物。合并所有反应产物，用OMEGA胶回收试剂 盒切胶纯化大小为1200bp的目的产物片段。纯化后的产物与pGMT-19Simple Vector在4度 连接过夜，钙法转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂带有IPTG和X-Gal和氨苄青霉素 的LB平板37°C培养过夜。挑取白色的单克隆菌落，接种入含氨苄青霉素的5ml LB试管中， 扩大培养。用OMEGA公司的小量质粒提取试剂盒提取质粒，用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。 质粒在Modulus公司的荧光定量仪上检测浓度，根据公式计算质粒中含有hzo基因的拷贝数 为2.70×10¹⁰copies/μl。对定量后的质粒进行10倍浓度稀释，制作2.70×10²-10⁷copies/μl浓度 梯度的标准品，并梯度稀释，置于-20°C冰箱保存待用。

3、厌氧氨氧化细菌的实时荧光定量PCR扩增

在进行荧光定量PCR反应时，不同批次的反应会有扩增效率的差别，通常在扩增效率在 0.9-1.1之间的PCR反应被认为是可以接受的和可以相互比较的。将标准质粒和样品DNA在 同一批进行PCR的扩增和定量，能够减少不同批次PCR反应扩增效率不同而产生的误差， 更加准确真实的定量厌氧氨氧化细菌的拷贝数。每个标准质粒DNA和样品DNA都至少设置 三个平行，结果取平均值。由于沉积物中残留的腐殖质等会对PCR扩增产生不同程度的抑制 作用，为了在不同样品之间获得更加接近的扩增效率，在进行定量PCR扩增之前，将所有样 品DNA在荧光定量仪Modulus上进行浓度测定，并将所有样品DNA的浓度调整到10ng/μl， 使不同样品之间的厌氧氨氧化细菌数量更加具有可比性。使用SYBR Green法进行荧光定量 PCR的扩增，反应总体积为15μl，反应体系含有以下成份（见表2）：

表2荧光定量PCR反应体系

荧光定量PCR在美国应用生物AB公司的7500扩增仪上进行，PCR反应程序为：95°C 预变性2min，95°C变性5s，55°C退火20s，72°C延伸30s，80°C延伸40s，循环40次，80°C 读取荧光值，并加熔解曲线检测产物特异性。

4、样品中厌氧氨氧化细菌数量的计算

反应结束后，扩增结果在仪器自带的软件上进行分析。以梯度稀释的标准质粒的拷贝数 为横轴，以对应的Ct值为纵轴，建立标准曲线。得到的厌氧氨氧化细菌实时荧光定量PCR 的标准曲线（见图1）显示，初始模板数与荧光值有较好的线性关系，回归系数大于0.99， 扩增效率高，斜率为-3.01。熔解曲线显示，荧光定量PCR产物无非特异性扩增（见图2）。 根据样品的Ct值可以计算出该样品中厌氧氨氧化细菌hzo基因的拷贝数，可实现对厌氧氨氧 化细菌的定量。