对动物卵母细胞内的染色体和纺锤体进行量化的方法

技术领域

本发明涉及一种对动物卵母细胞内的染色体和纺锤体进行量化分析的方法。

背景技术

由于动物卵母细胞发育的复杂性，需要直观、形象的高灵敏成像技术来实现对卵母细胞 内生命现象的三维立体观测和量化分析。卵母细胞对于个体发育不仅作为母源的单倍体配 子，同时也为合子的早期发育提供必要的物质来源。其发育过程要经历两次不对称的细胞分 裂，排出两个小极体，而最终形成单倍体配子。减数分裂的纺锤体对于不对称分裂的实现非 常重要，其形态、形状、及运动方式的异常都会造成其功能的紊乱，从而造成同源染色体或 者姐妹染色单体不能正常分离。而后者的异常分离，会引起卵母细胞染色体数量或结构上的 异常。因此，针对卵母细胞内染色体和纺锤体的研究具有重要意义。

然而，目前生物医学界对动物卵母细胞内染色体和纺锤体的研究主要采用分子生物学方 法，研究某个基因或蛋白功能的变化。该方法非常有利于生物分子机制的探究。但该方法的 实现必须要同时使用大量的细胞，并且破坏了他们的三维形态。

因此，现阶段对动物卵母细胞内的染色体和纺锤体进行研究方法仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出了一种对动物 卵母细胞内的染色体和纺锤体进行量化分析的方法。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种对动物卵母细胞内的染色体和纺锤体进行量 化分析的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：对动物卵母细胞内的染色体和 纺锤体进行荧光染色，其中，染色体和纺锤体被不同的荧光染料染色；利用荧光成像系统， 对经过荧光染色的染色体和纺锤体进行成像，以便获得该染色体和纺锤体的三维荧光图像； 以及基于该三维荧光图像，对卵母细胞内的染色体和纺锤体的特征参数进行量化分析。

根据本发明的实施例，本发明的对动物卵母细胞内的染色体和纺锤体进行量化分析的方 法，是一种形态学的研究方法，其利用荧光染色及三维成像技术能够在几乎不改变动物卵母 细胞原始形态的情况下，获得单个卵母细胞内的染色体及纺锤体的空间分布情况，而结合后 期的图像处理技术，即可量化地分析染色体及纺锤体的空间构象，直观地得到其三维信息， 能够为配子发育的研究提供重要的形态学数据。进一步，利用该方法能够在样本损耗量较小 的情况下，有效地对多个动物卵母细胞的染色体和纺锤体进行量化分析，进而通过量化分析 结果，能够宏观地认知各卵母细胞的三维结构，进一步，能够充分研究各卵母细胞之间的个 体差异，从而有利于本领域技术人员深入理解已有的相关分子生物学结果。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明 显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和 容易理解，其中：

图1显示了根据本发明的一个实施例的对动物卵母细胞内的染色体和纺锤体进行量化 分析的方法的流程示意图；

图2显示了根据本发明一个实施例的对经过荧光染色的动物卵母细胞的染色体和纺锤 体进行荧光成像及量化分析的流程图；

图3显示了根据本发明一个实施例的确定动物卵母细胞的纺锤体的三位荧光图像的长 度、宽度和弯折度的方法的示意图；

图4显示了根据本发明一个实施例，利用双光子成像系统同时双通路采集获得的经 Hoechst33342和QD585双色荧光标记的小鼠卵母细胞内染色体及纺锤体的三维荧光图像以 及两种三维荧光图像的叠加图片，其中a为第一通路（PMT1）接收到的纺锤体的三维荧光 图像，b为第二通路（PMT2）接收到的染色体体的三维荧光图像，c为a和b的叠加图片；

图5显示了根据本发明一个实施例，基于纺锤体的三维荧光图像对纺锤体进行量化分析 的方法的示意图，其中a、e为正常纺锤体的三维荧光图像，b、c、d为异常纺锤体的三维荧 光图像，f为e图中纺锤体的三维重构图，并且显示了以e图所示出的正常纺锤体的三维图 像为例计算纺锤体的特征参数的图示；以及

图6显示了基于染色体体的三维荧光图像对染色体进行量化分析的方法的示意图，其 中，a为正常染色体的三维荧光图像，b、c、d为异常染色体的三维荧光图像，(a’-d’)分别是 （a-d）相应的三维重构图，以及显示了以a和a’图所示出的正常染色体的三维图像为例计 算染色体的特征参数的图示。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或 类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的 实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对 重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种对动物卵母细胞内的染色体和纺锤体进行量 化分析的方法。根据本发明的实施例，参照图1，该方法包括以下步骤：

首先，对动物卵母细胞内的染色体和纺锤体进行荧光染色，其中，染色体和纺锤体被不 同的荧光染料染色。

接着，利用荧光成像系统，对经过荧光染色的染色体和纺锤体进行成像，以便获得该染 色体和纺锤体的三维荧光图像。

然后，基于该三维荧光图像，对卵母细胞内的染色体和纺锤体的特征参数进行量化分析。

根据本发明的实施例，该方法能够在不破坏卵母细胞细胞形态的情况下，针对单一个体 研究其内部染色体及纺锤体的空间分布，并使用一系列参数，量化分析染色体及纺锤体的三 维空间构象信息。发明人惊奇地发现，本发明对动物卵母细胞内的染色体和纺锤体进行量化 分析的方法，不仅样本损耗量小，而且能够充分研究卵母细胞之间的个体差异，非常有利于 本领域技术人员深入理解已有的分子生物学结果。

根据本发明的实施例，所述动物卵母细胞处于第一次减数分裂中期或第二次减数分裂中 期。这是因为，纺锤体作为临时细胞器，只在细胞分裂时形成，分裂结束后，解聚消失。

根据本发明的实施例，动物卵母细胞的种类不受特别限制，例如可以采用生物医学实验 中常用的模式动物的卵母细胞。其中，小鼠是生物医学领域最常用的模式动物。因而，根据 本发明的具体示例，动物卵母细胞为小鼠卵母细胞。由此，能够方便、容易地采集其卵母细 胞，从而能够高效地进行后续的实验。

根据本发明的实施例，对动物卵母细胞内的染色体和纺锤体进行荧光染色的方法不受特 别限制，只要能够同时对纺锤体和染色体进行双色荧光标记，进而能够被荧光成像系统区分 及捕获成像即可。根据本发明的一些实施例，通过免疫荧光染色法，利用第一荧光染料对所 述染色体进行荧光染色，利用第二荧光染料对所述纺锤体进行荧光染色，其中，所述第一荧 光染料和所述第二荧光染料不同。由此，能够准确有效地对动物卵细胞内纺锤体和染色体进 行双色荧光标记。

其中，根据本发明的实施例，第一荧光染料和第二荧光染料的种类也不受特别限制，只 要能够同时对纺锤体和染色体进行双色荧光标记即可。根据本发明的一些具体示例，所述 第一荧光染料为Hoechst33342染料，所述第二荧光染料为QD585。

具体地，根据本发明的一些实施例，对动物卵母细胞内的染色体和纺锤体进行荧光染色， 可以进一步包括：

将处于第一次减数分裂中期（MI期）或第二次减数分裂中期（MII期）的动物卵母细 胞依次进行戊二醛固定、Triton X-100打孔，血清封闭，结合一抗，二抗孵育以及结合荧光 三抗的处理，以便对该动物卵母细胞的纺锤体进行荧光标记；以及

利用Hoechst33342对该动物卵母细胞进行染色体复染，以便完成对该动物卵母细胞内 的纺锤体和染色体的双色荧光标记。

根据本发明的实施例，荧光成像系统的类型不受特别限制。根据本发明的一些具体示例， 所述荧光成像系统为双光子荧光成像系统。这是因为，双光子荧光成像系统具有穿透能力深、 光损伤小、光漂白区域小、三维空间分辨率高、荧光信号收集效率高等特点。在本发明的方 法中，利用该系统能够同时双通路高效采集动物卵母细胞内染色体及纺锤体的三维荧光图 像，并且相对于一般的荧光成像系统，其获得的三维荧光图像分辨率更高。

根据本发明的实施例，基于所述三维荧光图像，对所述卵母细胞内的染色体和纺锤体的 特征参数进行量化分析可以进一步包括：从所述三维荧光图像中，分割出所述染色体和纺锤 体的图像；利用所述染色体和纺锤体的图像，对所述染色体和纺锤体进行三维空间重构，以 便获得所述染色体和纺锤体的立体图像；基于所述染色体和纺锤体的立体图像确定所述染色 体和纺锤体的特征参数。由此，能够有效地确定卵母细胞内的染色体和纺锤体的特征参数， 从而能够实现对卵母细胞内的染色体和纺锤体的量化分析。

根据本发明的实施例，在从所述三维荧光图像中，分割出所述染色体和纺锤体的图像之 前，对所述三维荧光图像进行除噪处理和去卷积处理。由此，能够有效地对三维荧光图像进 行除杂，从而能够获得高质量的荧光图像。

根据本发明的实施例，发明人基于染色体和纺锤体的立体图像，确定两者的形态、形状 和空间分布三个角度的特征参数，从而实现对染色体的量化分析。根据本发明的具体示例， 所述染色体的特征参数包括选自下列的至少一种：染色体的体积、染色体的表面积、染色体 的类圆因子、染色体的光滑因子、染色体之间的平均距离以及染色体之间的粘连程度，所述 纺锤体的特征参数包括选自下列的至少一种：纺锤体的体积、纺锤体的表面积、纺锤体的长 度、纺锤体的宽度、纺锤体的弯折度以及纺锤体的形状。

根据本发明的实施例，上述染色体和纺锤体的各特征参数的计算方法不受特别限制，只 要能够准确地表征相应的特征即可。根据本发明的具体示例，通过下述公式计算所述染色体 或纺锤体的体积：

V=ΣVoxels×V_P，

其中，V表示所述染色体或纺锤体的体积，ΣVoxels表示对所述染色体和纺锤体的立体 图像内的所有像素点求和，V_P表示一个像素点所对应的实际体积大小。

根据本发明的一些实施例，利用Amira软件计算染色体或纺锤体的表面积。具体地，利 用Amira软件确定染色体和纺锤体的立体图像内边界像素的数目，并进一步计算得出染色体 或纺锤体的表面积。需要说明的是，这里所使用的术语“边界像素”是指染色体或纺锤体与 外界空间接触的最外层像素。

根据本发明的一些实施例，所述染色体的类圆因子是基于下列公式确定的：

$\mathrm{RF}=36\pi \frac{V^2}{S^3},$

其中，RF表示所述染色体的类圆因子，V和S分别为所述染色体的体积和表面积。

根据本发明的一些实施例，通过下述公式计算所述染色体的光滑因子：

$\mathrm{SF}=\frac{\frac{3}{5}{\left[\frac{3}{4\pi }\right]}^{\frac{2}{3}}{V}^{\frac{5}{3}}}{\Sigma [{(x-x_c)}^2+{(y-y_c)}^2+{(z-z_c)}^2]{\Delta }_x{\Delta }_y{\Delta }_z},$

其中，

SF表示所述染色体的光滑因子，V为所述染色体的体积，(x_C,y_C,z_C)表示图像前景目标 区域的重心坐标，分母是该目标区域内各像素点与重心坐标的距离平方总和，其中 $(x_c,y_c,z_c)=(\frac{1}{\underset{i=1}{\overset{N}{\Sigma }}{g}_i}\underset{i=1}{\overset{N}{\Sigma }}{g}_i·x_i,\frac{1}{\underset{i=1}{\overset{N}{\Sigma }}{g}_i}\underset{i=1}{\overset{N}{\Sigma }}{g}_i·y_i,\frac{1}{\underset{i=1}{\overset{N}{\Sigma }}{g}_i}\underset{i=1}{\overset{N}{\Sigma }}{g}_i·z_i),$(x_i,y_i,z_i)表示目标区域内第i个像素 点的空间坐标，N表示目标区域内所有的像素点，g_i表示第i个像素点的灰度值。其中，需 要说明的是，对于实心表面光滑球体，其SF数值为1；对于任何其他表面粗糙或者内部有 空洞的物体（非实心物体），其SF值小于1。在本文中所使用的表达方式“图像前景目标区 域”是指染色体或者纺锤体所占的区域。

根据本发明的一些实施例，通过下述公式计算所述染色体之间的平均距离：

$\bar{L}=\frac{\underset{i=1}{\overset{n}{\Sigma }}{L}_i}{20},$

其中，表示所述染色体之间的平均距离，L_i代表第i条染色体重心与染色体分布区域 重心之间的距离。根据本发明的实施例，染色体之间的平均距离越长，表明染色体在卵母细 胞内的分布越分散；染色体之间的平均距离越短，则表示染色体在卵母细胞内的分布越紧密。 另外，对于荧光光团相互掺杂无法分割的多条染色体，发明人将组成该荧光光团的所有染色 体与染色体分布区域重心之间的距离视为相同。

根据本发明的实施例，在本发明的方法中，计算染色体的粘连程度方法不受特别限制， 根据本发明的一些具体示例，针对小鼠卵母细胞的纺锤体和染色体进行量化分析时，将不能 分割出10个荧光光团的卵母细胞占其所在实验组所有卵母细胞的比率定义为该实验组的粘 连程度。这是因为，在第一次减数分裂过程中，小鼠卵母细胞内共有20个四分体，而经双 光子成像系统所得到的20个四分体的荧光图像会出现某些四分体的荧光相互掺杂，无法分 割的现象，则同一实验组中，不能分割出10个荧光光团的卵母细胞占该实验组所有卵母细 胞的比率可以表现该实验组的染色体的粘连程度。具体计算方法如：一实验组共有53个卵 母细胞，不能分割出10个荧光光团的卵母细胞数目为29个，因此该实验组染色体的粘连程 度约为55%。

根据本发明的实施例，参照图3，纺锤体的长度、宽度和弯折度的计算方法如下：如图 3a所示，以纺锤体两级之间的距离表示纺锤体的长度，以纺锤体横向即赤道方向的最大距 离表示纺锤体的宽度。而对于形状弯曲的纺锤体，发明人用纺锤体的弯折度来表征其弯曲程 度，具体地，根据本发明的一些实施例，在本发明的方法中，以纺锤体两级相对于染色体平 面重心的角度来表示纺锤体的弯折度（见图3b）。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例 仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按 照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明 生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：对小鼠卵母细胞的纺锤体和染色体进行量化分析

1、免疫荧光染色

首先，将处于第一次减数分裂中期（MI期）或第二次减数分裂中期（MII期）的小鼠 卵母细胞依次进行戊二醛固定、Triton X-100打孔，山羊血清或兔血清封闭，一抗4℃过夜， 特定二抗孵育以及结合荧光三抗的处理，以便对该小鼠卵母细胞的纺锤体进行荧光标记，然 后利用Hoechst33342复染该动物卵母细胞的染色体，以便使该动物卵母细胞内的纺锤体和 染色体被不同的荧光染料染色。具体步骤如下：

1.1戊二醛固定

利用2.5%的戊二醛，将上述小鼠卵母细胞于室温下，进行戊二醛固定30min。

1.2Triton X-100打孔

利用0.01M PBS将经过戊二醛固定的小鼠卵母细胞清洗三遍后，于室温下，利用0.5% Triton X-100进行打孔处理20min。

1.3血清封闭

利用0.01M PBS将经过打孔处理的小鼠卵母细胞清洗三遍后，于室温下，利用山羊血 清进行封闭处理20min。

1.4结合一抗（纺锤体标记物）

于4℃下，将一抗——兔抗β-tubulin（或α-tubulin）与经过封闭处理的小鼠卵母细胞一 起孵育过夜，以便获得结合一抗的小鼠卵母细胞。

1.5二抗孵育

利用0.01M PBS将上述获得的结合一抗的小鼠卵母细胞清洗三遍后，于室温下，与二 抗——山羊抗兔生物素化IGG一起孵育30min，以便获得结合二抗的小鼠卵母细胞。

1.6结合荧光三抗

利用0.01M PBS将上述获得的结合二抗的小鼠卵母细胞清洗三遍后，于37℃下，与荧 光三抗——卵白素化量子点QD585一起孵育60min，以便获得结合荧光三抗，完成纺锤体 荧光标记的小鼠卵母细胞。

1.7Hoechst33342复染核区

利用0.01M PBS将上述获得的结合荧光三抗的小鼠卵母细胞清洗三遍后，于室温下， 利用5μg/mL的Hoechst33342对该结合荧光三抗的小鼠卵母细胞进行核区复染15min，然 后利用0.01M PBS清洗三遍，以便完成卵母细胞内纺锤体及染色体的双色荧光标记

2、荧光成像

接着，利用双光子荧光成像系统（该成像系统由美国伯乐公司的MRC1024扫描单元， 日本尼康公司的TE300，以及美国光谱物理公司的飞秒激光器Tsunami组合而成），对经过 荧光染色的染色体和纺锤体进行成像，以便获得该染色体和纺锤体的三维荧光图像。结果见 图4，如图4所示，利用该系统能够同时双通路高效采集经Hoechst33342和QD585双色荧 光标记的小鼠卵母细胞内染色体及纺锤体的三维荧光图像，其中，第一通路（PMT1）接收 来自纺锤体的信号（图4a），第二通路（PMT2）接收来自染色的信号（图4b）。两通路的叠 加图片如图4c所示，其中，图4中标尺=6μm。

然后，将上述获得的三维荧光图像进行去噪处理和去卷积处理，以便能够有效地对三维 荧光图像进行除杂，获得高质量的荧光图像。

3、量化分析

基于上述经过除噪处理和去卷积处理的三维荧光图像，对卵母细胞内的染色体和纺锤体 的特征参数进行量化分析。

其中，量化分析的具体步骤如下：从上述三维荧光图像中，分割出染色体和纺锤体的图 像；利用染色体和纺锤体的图像，对染色体和纺锤体进行三维空间重构，以便获得该染色体 和纺锤体的立体图像；以及基于染色体和纺锤体的立体图像确定该染色体和纺锤体的特征参 数。其中，染色体的特征参数包括选自下列的至少一种：染色体的体积、染色体的表面积、 染色体的类圆因子、染色体的光滑因子、染色体之间的平均距离以及染色体之间的粘连程度， 纺锤体的特征参数包括选自下列的至少一种：纺锤体的体积、纺锤体的表面积、纺锤体的长 度、纺锤体的宽度、纺锤体的弯折度以及纺锤体的形状。

进一步，各特征参数的计算方法如下：

（1）通过下述公式计算染色体或纺锤体的体积：

V=ΣVoxels×V_P，

其中，V表示染色体或纺锤体的体积，ΣVoxels表示对染色体和纺锤体的立体图像内的 所有像素点求和，V_P表示一个像素点所对应的实际体积大小。

（2）利用Amira软件确定染色体和纺锤体的立体图像内边界像素的数目，并进一步计 算得出染色体或纺锤体的表面积。

（3）基于下列公式确定染色体的类圆因子：

$\mathrm{RF}=36\pi \frac{V^2}{S^3},$

其中，RF表示所述染色体的类圆因子，V和S分别为所述染色体的体积和表面积。

（4）通过下述公式计算所述染色体的光滑因子：

$\mathrm{SF}=\frac{\frac{3}{5}{\left[\frac{3}{4\pi }\right]}^{\frac{2}{3}}{V}^{\frac{5}{3}}}{\Sigma [{(x-x_c)}^2+{(y-y_c)}^2+{(z-z_c)}^2]{\Delta }_x{\Delta }_y{\Delta }_z},$

其中，

SF表示所述染色体的光滑因子，V为所述染色体的体积，(x_C,y_C,z_C)表示图像前景目标 区域的重心坐标，分母是该目标区域内各像素点与重心坐标的距离平方总和，其中 $(x_c,y_c,z_c)=(\frac{1}{\underset{i=1}{\overset{N}{\Sigma }}{g}_i}\underset{i=1}{\overset{N}{\Sigma }}{g}_i·x_i,\frac{1}{\underset{i=1}{\overset{N}{\Sigma }}{g}_i}\underset{i=1}{\overset{N}{\Sigma }}{g}_i·y_i,\frac{1}{\underset{i=1}{\overset{N}{\Sigma }}{g}_i}\underset{i=1}{\overset{N}{\Sigma }}{g}_i·z_i),$(x_i,y_i,z_i)表示目标区域内第i个像素 点的空间坐标，N表示目标区域内所有的像素点，g_i表示第i个像素点的灰度值。

（5）通过下述公式计算染色体之间的平均距离：

$\bar{L}=\frac{\underset{i=1}{\overset{n}{\Sigma }}{L}_i}{20},$

其中，表示所述染色体之间的平均距离，L_i代表第i条染色体重心与染色体分布区域 重心之间的距离。

（6）染色体的粘连程度，以不能分割出10个荧光光团的卵母细胞占其所在实验组所有 卵母细胞的比率表示。

（7）如图3所示，以纺锤体两级之间的距离表示纺锤体的长度，以纺锤体横向即赤道 方向的最大距离表示纺锤体的宽度，以纺锤体两级相对于染色体平面重心的角度来表示纺锤 体的弯折度。

其中，图2显示了本实施例的对经过荧光染色的动物卵母细胞的染色体和纺锤体进行荧 光成像及量化分析的流程图。如图2所示，对经过荧光染色的卵母细胞的染色体和纺锤体进 行荧光成像及量化分析的流程，具体为：

利用双光子成像系统对经过荧光染色的染色体和纺锤体进行成像，其中，图像采集部分 (Image acquisition)：近红外飞秒激光（波长：730nm；平均输出功率：470mW）经二色片 TS1（625ESP，Chroma公司）反射，及100×oil物镜聚焦到样品焦平面上，以激发标记纺 锤体的QD585和标记染色体的Hoechst33342。纺锤体和染色体的荧光信号经同一物镜收集， 通过另外一个二色片VHS（510DCLP，Chroma公司）分束，分别被两个光电倍增管探测器 （PMT）接收。其中PMT1接收来自纺锤体的荧光信号，PMT2接收染色体的荧光信号。图 中空心箭头实线箭头（→）、虚线箭头分别表示激发光、纺锤体荧光信号、染色 体荧光信号的行走路径。图像预处理部分(Image preprocessing)：将采集到的原始信号，进 行中值滤波去噪、去卷积操作以进一步图像复原、及前景目标（纺锤体及染色体）的三维分 割。图像量化分析部分(Image analysis)：发明人分别根据前述方法计算①染色体的体积 （Volume）、表面积（Surface）、类圆因子（RF）、光滑因子（SF），及染色体之间的平均距 离（distance）和粘连程度（adhesion）；②纺锤体的体积（Volume）、表面积（Surface）、长 度（Length）、宽度（Width）、弯折度（Bend），及形状（shape）。

图5显示了基于纺锤体的三维荧光图像对纺锤体进行量化分析的方法的示意图，其中a、 e为正常纺锤体的三维荧光图像；b、c、d为异常纺锤体的三维荧光图像；并且，显示了以e 图所示出的正常纺锤体的三维图像为例计算纺锤体的特征参数的图示；f为e图中纺锤体的 三维重构图。如图5所示，正常的纺锤体成两头尖尖的纺锤梭状（见图5a，e）。异常纺锤体： ①出现多极（见图5b）；②有纺锤体形状，但纺锤丝紊乱的分布于胞质中，形成大大小小不 等的荧光团（如箭头所示）（见图5c）；③无纺锤体状，纺锤丝紊乱的分布于胞质（见图5d）。 图中纺锤体均以伪彩色显示，纺锤体的荧光标记物为QD585。

图6显示了基于染色体体的三维荧光图像对染色体进行量化分析的方法的示意图，其 中，a为正常染色体的三维荧光图像；b、c、d为异常染色体的三维荧光图像；(a’-d’)分别是 相应（a-d）的三维重构图；并且，显示了以a和a’图所示出的正常染色体的三维图像为例 计算染色体的特征参数的图示。如图6所示，正常的染色体，在第二次减数分裂中期，整齐 的排列在赤道面上（见图6a，a’）。异常染色体排布为：①染色体排列不整齐（见图6b，b’）； ②错位染色体（如箭头所示，见图6c，c’）；③染色体聚集成团（见图6d，d’）。图中染色体 的荧光标记物为Hoechst33342，以伪彩形式显示。

实施例2：

氨甲喋呤(MTX)是一种抗肿瘤药物，它能通过抑制二氢叶酸还原酶(DHFR)的活性，干 扰一碳单位的代谢过程以及DNA的合成。本实施例，利用实施例1所述的方法，对注射了 氨甲喋呤药物(MTX)的小鼠的卵母细胞的纺锤体和染色体进行量化分析，以便研究氨甲喋呤 药物对小鼠卵母细胞内纺锤体及染色体的影响，具体方法如下：

发明人将MTX以5mg/Kg的药物剂量腹腔注射于ICR小鼠（也称为CD1小鼠）体内， 然后取小鼠体内成熟的MII期卵母细胞，以正常小鼠的MII期卵母细胞为对照，按照实施例 1所述的方法，对其进行纺锤体和染色体的三维构象情况检测和量化分析，结果见图5，图 6。图5显示了注射了氨甲喋呤药物(MTX)的小鼠的卵母细胞及对照小鼠卵母细胞的纺锤体 的量化分析结果，而图6显示了注射了氨甲喋呤药物(MTX)的小鼠的卵母细胞及对照小鼠卵 母细胞的染色体的量化分析结果。

具体地，如图5所示，a、e为对照小鼠卵母细胞中正常纺锤体的三维荧光图像；b、c、 d为注射了氨甲喋呤药物(MTX)的小鼠的卵母细胞中纺锤体的三维荧光图像。由图5可知， 正常的纺锤体成两头尖尖的纺锤梭状（见图5a，e），而注射了氨甲喋呤药物(MTX)的小鼠的 卵母细胞的纺锤体形态异常：①出现多极（见图5b）；②有纺锤体形状，但纺锤丝紊乱的分 布于胞质中，形成大大小小不等的荧光团（如箭头所示）（见图5c）；③无纺锤体状，纺锤 丝紊乱的分布于胞质（见图5d）。如图6所示，a为对照小鼠卵母细胞中正常染色体的三维 荧光图像；b、c、d为注射了氨甲喋呤药物(MTX)的小鼠的卵母细胞中染色体的三维荧光图 像；(a’-d’)分别是（a-d）相应的三维重构图。由图6可知，正常的染色体，在第二次减数分 裂中期；整齐的排列在赤道面上（见图6a，a’），而注射了氨甲喋呤药物(MTX)的小鼠的卵 母细胞的染色体排布异常：①染色体排列不整齐（见图6b，b’）；②错位染色体（如箭头所 示，见图6c，c’）；③染色体聚集成团（见图6d，d’）。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、 或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包 含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指 的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个 或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本 发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的 范围由权利要求及其等同物限定。