具有抗肿瘤活性的植物提取物及其活性成分

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及从朝鲜黄杨（Buxus microphylla var.koreana Nakai）的叶子提取分离得到具有体外抗肿瘤活性的总生物碱及其制备方法，以及从朝鲜黄杨叶子总生物碱中分离得到五种具有体外抗肿瘤活性的黄杨生物碱类化合物及其制备方法。 

背景技术

黄杨生物碱为仅分布于黄杨科（Buxaceae）黄杨属（Buxus）植物中的一系列具有降环阿尔廷型三萜基本骨架的生物碱类化合物。该类化合物目前报道已有220余种[Yu-xin Yan，Current Bioactive Compound，2011，47-64]，大多具有治疗心肌缺血、抗老年痴呆和抗菌等活性。其中环维黄杨星D（cyclovirobuxin D）被收录于2010年《中国药典》一部，用于治疗冠心病、心律失常等，临床制剂有黄杨宁片。 

黄杨属植物全世界有70余种。分布于亚洲、欧洲、热带非洲以及古巴、牙买加等处。我国已知约17种及几个亚种和变种，西自西藏，东至台湾，南自海南岛，西北至甘肃南部均产，但主要分布于我国西部和西南部[中国植物志]。朝鲜黄杨（Buxus microphylla var.koreana Nakai）为小叶黄杨的变种，原产朝鲜半岛，于二十世纪三四十年代引种于我国辽宁省各地。不同于分布于我国的黄杨属其他植物，其具有高度耐寒（-35℃）的特性，从而广泛用于辽宁和吉林省的园林绿化，目前已经在辽宁省沈阳市周边地区有大量人工栽培。而对朝鲜黄杨中三萜类生物碱的报道却仅有一篇1966年的文献[Nakano T.，Journal of the Chemical Society C：Organic，1966，1805-1810]，从其中分离得到8个生物碱。 

近年来，有报道从小叶黄杨中分离得到的具有体外抗肿瘤作用的黄杨生物碱[Yu-xin Yan，Journal of Natural Products，2009，308-311]，但据文献[王玲玲，哈尔滨师范大学自然科学学报，2008，74-76]中报道的朝鲜黄杨在过氧化物酶和酯酶同工酶酶谱上和小叶黄杨以及锦熟黄杨存在明显差异以及朝鲜黄杨在生长环境上与该属其他植物鲜明的差异性，可以预见朝鲜黄杨在化学成分及生物活性方面与该属其他植物存在区别。 

本发明所涉及的朝鲜黄杨叶子中提取分离得到的总生物碱及其抗肿瘤活性，迄今为止国内外尚未见有与此雷同的相关专利或文献报道。本发明所涉及的从朝鲜黄杨叶子总生物碱中分离得到的5个新黄杨生物碱类化合物，迄今在国内外尚未见有与此雷同的化合物及抗肿瘤活性的相关专利或文献报道。 

发明内容

本发明提供一种以朝鲜黄杨叶子为原料制备得到的总生物碱及制备方法，以及其在制备 人宫颈癌HeLa细胞株，人乳腺癌MCF-7细胞株，人肺癌A549细胞株，人肝癌HepG-2细胞株和人白血病K562细胞株抑制剂中的应用。 

本发明又提供五种仅从朝鲜黄杨叶子总生物碱中分离得到的新黄杨生物碱类化合物及制备方法，以及其在制备人宫颈癌HeLa细胞株抑制剂中的应用。 

本发明所述五种仅从朝鲜黄杨叶子总生物碱中分离得到的新黄杨生物碱类化合物的结构如式I～V所示： 

V 

本发明的制备技术方案包括如下步骤： 

以朝鲜黄杨干燥叶子1kg为原料，用15～20升0.1%～0.3%盐酸水溶液渗漉提取，提取液用1%～5%氢氧化钠水溶液碱化至pH=10～11后，采用大孔吸附树脂1～2kg动态吸附，用pH=10～11的氢氧化钠水溶液洗脱3～5个保留体积后，用95%乙醇洗脱4～6个保留体积，95%乙醇洗脱部分回收溶剂得到朝鲜黄杨叶子的总生物碱提取物。 

以朝鲜黄杨叶子的总生物碱提取物为原料，经200～300目硅胶柱色谱分离，分别以体积配比为3：1，1：1和0：1的石油醚-丙酮的混合溶剂梯度洗脱，将其中石油醚-丙酮体积配比为3：1的洗脱部分再经过200～300目氧化铝柱色谱分离，以体积配比为100：2的石油醚-丙酮的混合溶剂洗脱得到如式IV化合物，以体积配比为100：10的石油醚-丙酮的混合溶剂洗脱得到如式III化合物，将其中石油醚-丙酮体积配比为1：1的洗脱部分再经过开放ODS柱色谱分离，以5%～80%的甲醇水溶液梯度洗脱，其中35%～50%甲醇水溶液洗脱物中得到式II化合物，将其中石油醚-丙酮体积配比为0：1的洗脱部分经HPD-100型大孔吸附树脂柱色谱分离，以35%和80%的乙醇水溶液梯度洗脱，其中35%乙醇水溶液洗脱物中得到式V化合物，85%乙醇水溶液洗脱物中得到式I化合物。 

如上所述式I～V化合物的结构鉴定采用各种波谱技术：主要利用包括高分辨质谱、核磁共振谱（¹H NMR，¹³C NMR，2D-NMR）。 

采用MTT法测试如上所述朝鲜黄杨叶子的总生物碱对人宫颈癌HeLa细胞株，人乳腺癌MCF-7细胞株，人肺癌A549细胞株，人肝癌HepG-2细胞株和人白血病K562细胞株的体外抗肿瘤作用，试验结果表明朝鲜黄杨叶子的总生物碱在体外对上述五种细胞株具有显著细胞毒作用，其IC₅₀值分别为16.54±1.86μg/mL，30.45±2.68μg/mL，9.40±1.06μg/mL，40.56±4.23μg/mL和9.55±1.56μg/mL，因此，本发明所述的朝鲜黄杨叶子的总生物碱具有制备临床肿瘤预防和治疗药物的前景。 

采用MTT法测试从朝鲜黄杨叶子的总生物碱中分离得到的如式I～V的化合物对人宫颈癌HeLa细胞株的体外抗肿瘤作用，试验结果表明如式I～V的化合物在体外对人宫颈癌HeLa细胞株具有细胞毒作用，其IC₅₀值分别为13.27±1.68μM，14.85±1.39μM，29.49±9.32μM，31.20±4.07μM和36.29±4.12μM，因此，本发明所述的从朝鲜黄杨叶子的总生物碱中分离得到的如式I～V的化合物具有制备临床肿瘤预防和治疗药物的前景。 

本发明的优点在于，所采用的原料容易大量获取，所得总生物碱具有比较显著的抗肿瘤活性，所得到的单体化合物结构新颖，且具有体外抗肿瘤活性，总生物碱及其中活性单体化合物的提取分离方法简易，便于对其进行进一步的药理和临床研究，为开发疗效好且毒副作 用小的新型抗肿瘤药物创造条件。 

具体实施方式：

下面所列实施例有助于本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。 

实施例1：朝鲜黄杨叶子总生物碱的制备： 

朝鲜黄杨叶（1600g）剪碎，用0.2%HCl水溶液（5L）浸泡12h后，用0.2%HCl水溶液渗漉提取，共得到酸水提取液29L，酸水液用5%NaOH水溶液碱化至pH=11，得到碱水液约30L，将碱水液用HPD-100型大孔吸附树脂1.5kg动态吸附，在用pH=11的NaOH水溶液洗脱4个保留体积后，用95%乙醇洗脱5个保留体积，95%乙醇洗脱部分回收溶剂得到总生物碱（18g）。 

实施例2：朝鲜黄杨叶子总生物碱（实施例1）的体外抗肿瘤活性 

取对数生长期的受试细胞，以(2-3)×10⁴cells/mL的密度接种于96孔培养板内，每孔内100μL，使其贴壁24h后，加入用培养液稀释成不同浓度的待测化合物100μL，于37℃继续培养96h。然后每孔加入50μL MTT溶液于37℃孵育4h后，弃取上清液，每孔加入200μL DMSO，室温振荡10min后，在酶标仪570nm处测量每个孔的吸光度值，设A1（含200μL DMSO）为空白对照孔，以顺铂（CP）为阳性对照。利用下列公式求得肿瘤细胞生长抑制率：1-（加药孔吸光度值/对照孔吸光度值）×100%。所求结果代入IC₅₀计算软件，求出IC₅₀值。其IC₅₀结果如表1所示。 

表1 朝鲜黄杨叶子总生物碱（CXHY-YS）的体外抗肿瘤活性 

体外实验结果表明朝鲜黄杨叶子总生物碱在体外对多种人癌细胞株显示出细胞毒作用，尤其是对人乳腺癌MCF-7细胞株，人肝癌HepG-2细胞株和人白血病K562细胞株，具有和阳性对照药顺铂同一数量级的活性，有望开发其在制备人宫颈癌HeLa细胞株，人乳腺癌MCF-7细胞株，人肺癌A549细胞株，人肝癌HepG-2细胞株和人白血病K562细胞株抑制剂中的应用。 

实施例3：朝鲜黄杨叶子总生物碱（实施例1）中如式I～V的五种单体化合物的制备方法 

以朝鲜黄杨叶子的总生物碱提取物18g为原料，经200～300目硅胶柱色谱分离，分别以体积配比为3：1，1：1和0：1的石油醚-丙酮的混合溶剂梯度洗脱，将其中石油醚-丙酮体积配比为3：1的洗脱部分再经过200～300目氧化铝柱色谱分离，以体积配比为100：2的石 油醚-丙酮的混合溶剂洗脱得到如式IV化合物（6.0mg），以体积配比为100：10的石油醚-丙酮的混合溶剂洗脱得到如式III化合物（5.2mg），将其中石油醚-丙酮体积配比为1：1的洗脱部分再经过开放ODS柱色谱分离，以5%～80%的甲醇水溶液梯度洗脱，其中35%～50%甲醇水溶液洗脱物中得到式II化合物（3.0mg），将其中石油醚-丙酮体积配比为0：1的洗脱部分经HPD-100型大孔吸附树脂柱色谱分离，以35%和80%的乙醇水溶液梯度洗脱，其中35%乙醇水溶液洗脱物中得到式V化合物（13mg），85%乙醇水溶液洗脱物中得到式I化合物（20mg）。 

实施例4：朝鲜黄杨叶子总生物碱中如式I～V的五种单体化合物的结构鉴定 

式I化合物：无色针状结晶（石油醚-丙酮），碘化铋钾反应阳性，HR-ESI-MS：[M+H]⁺m/z356.2945（calcd356.2953），确定分子式为C₂₄H₃₇NO。¹H NMR（600MHz，CDCl₃），¹³C NMR（150MHz，CDCl₃）以及HMBC数据归属见表2。 

表2 式I化合物的NMR信号归属 

式II化合物：无色针状结晶（石油醚-丙酮），碘化铋钾反应阳性，HR-ESI-MS：[M+H]⁺m/z368.2942（calcd368.2953），确定分子式为C₂₅H₃₇NO。¹H NMR（600MHz，CDCl₃），¹³C NMR（150MHz，CDCl₃）以及HMBC数据归属见表3。 

表3 式II化合物的NMR信号归属 

式III化合物：无色针状结晶（石油醚-丙酮），碘化铋钾反应阳性，HR-ESI-MS：[M+H]⁺m/z368.2940（calcd368.2953），确定分子式为C₂₅H₃₇NO。¹H NMR（600MHz，CDCl₃），¹³C NMR（150MHz，CDCl₃）以及HMBC数据归属见表4。 

表4 式III化合物的NMR信号归属 

式IV化合物：无色针状结晶（石油醚-丙酮），碘化铋钾反应阳性，HR-ESI-MS：[M+H]⁺m/z370.3107（calcd370.3110），确定分子式为C₂₅H₃₉NO。¹H NMR（600MHz，CDCl₃），¹³C NMR（150MHz，CDCl₃）以及HMBC数据归属见表5。 

表5 式IV化合物的NMR信号归属 

式V化合物：无色针状结晶（石油醚-丙酮），碘化铋钾反应阳性，HR-ESI-MS：[M+H]⁺m/z385.3578（calcd385.3583），确定分子式为C₂₆H₄₄N₂。¹H NMR（600MHz，pyridine-d₅）， ¹³C NMR（150MHz，pyridine-d₅）以及HMBC数据归属见表6。 

表6 式V化合物的NMR信号归属 

实施例5：朝鲜黄杨叶子总生物碱中如式I～V的五种单体化合物的体外抗肿瘤活性 

具体试验方法同实施例2中所述，以文献报道的从朝鲜黄杨中得到的cyclokoreanine B （CB）[Nakano T.，Journal of the Chemical Society C：Organic，1966，1805-1810]为阳性对照，测试了式I～V五个单体化合物对人宫颈癌HeLa细胞株的细胞毒作用，其IC₅₀结果如表7所示。 

表7 朝鲜黄杨叶子总生物碱中如式I～V的五种单体化合物的对HeLa细胞株的细胞毒作用 

体外实验结果表明朝鲜黄杨叶子总生物碱中如式I～V的五种单体化合物在体外对人宫颈癌HeLa细胞株具有细胞毒作用，IC₅₀值范围为13～37μM，有望开发其在制备人宫颈癌HeLa细胞株抑制剂中的应用。