使用具有大孔中性吸附树脂的吸附-脱附色谱用于富集衍生自甜叶菊的糖苷组合物中的新蛇菊苷B和/或新蛇菊苷D的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求享有2010年11月19日提交的，名为“METHOD FOR THE  ENRICHMENT OF REBAUDIOSIDE AND/OR REBADIOSIDE D IN  STEVIA-DERIVED GLYCOSIDE COMPOSITIONS USING  ABSORB-DESORB CHROMATOGRAPHY WITH A MACROPOROUS  NUETRAL ADSORBENT RESIN”的美国临时专利申请61/415,548的权益， 将其全部援引加入本文。

技术领域

本发明涉及使用吸附/脱附色谱以制备包含新蛇菊苷B和/或新蛇菊苷 D(reb-B和/或reb-D)的经富集的组合物。如本文所述，已经发现使用吸附- 脱附色谱工艺从衍生自甜叶菊的糖苷组合物中可制备经富集的reb-B和/或 reb-D，该色谱工艺中色谱床的固定相包含大孔中性吸附树脂。可用树脂的 实例包括“SP70”和“SP710”(购自Mitsubishi)和“FPX66”(购自Dow)。

发明内容

在一些实施方案中，本发明提供了制备包含reb-B、reb-D的至少一种 或它们的混合物的经富集的组合物的方法，该方法包括以下步骤：

(A)提供pH经调节的衍生自甜叶菊的糖苷溶液，其包含：(i)选自reb-B 和reb-D的至少一种糖苷，和(ii)至少一种其他的衍生自甜叶菊的糖苷；

(B)提供大孔中性吸附树脂；

(C)使大孔中性吸附树脂与衍生自甜叶菊的糖苷溶液接触，以使衍生自 甜叶菊的糖苷溶液中的至少一部分糖苷被吸附至吸附剂上；

(D)提供至少一种包含乙醇和水的混合物的洗脱溶剂，配制该洗脱溶 剂，以从吸附剂选择性地洗脱reb-B、reb-D或它们的混合物；

(E)使大孔中性吸附树脂与乙醇和水的洗脱溶剂接触，以洗脱富集选自 reb-B和reb-D的至少一种糖苷的组合物；以及

(F)任选地从大孔中性吸附树脂洗脱至少一部分剩余的被吸附的糖苷。

在本发明的某些实施方案中，衍生自甜叶菊的糖苷溶液的pH可以是碱 性的pH。在这些实施方案的某些中，pH经调节的衍生自甜叶菊的糖苷溶 液的pH可以为约8至约11。在其他实施方案中，pH经调节的衍生自甜叶 菊的糖苷溶液的pH可以为约8至约10。在这些实施方案的一些中，至少 一种洗脱溶剂包含约20-35%w/w的乙醇和约65-80%w/w的水。在其他的 实施方案中，至少一种洗脱溶剂包含约25-33%w/w的乙醇和约67-75%w/w 的水。在这些实施方案中，富集至少一种糖苷的组合物富集reb-B和reb-D。 在这些实施方案的一些中，用后续洗脱溶剂从大孔中性吸附树脂洗脱至少 一部分剩余的被吸附的糖苷，其中后续洗脱溶剂包含约36-100%w/w的乙 醇和约0-64%w/w的水，并且用后续洗脱溶剂洗脱的组合物富集reb-A。

在本发明的其他特别的实施方案中，衍生自甜叶菊的糖苷溶液的pH可 以是略酸性的pH。在这些实施方案中，pH经调节的衍生自甜叶菊的糖苷 溶液的pH可以为约4至约7。在这些实施方案的一些中，至少一种洗脱溶 剂包含约20-35%w/w的乙醇和约65-80%w/w的水。在其他的实施方案中， 至少一种洗脱溶剂包含约25-33%w/w的乙醇和约67-75%w/w的水。在这 些实施方案中，富集至少一种糖苷的组合物富集reb-D。在这些实施方案的 一些中，用后续洗脱溶剂从大孔中性吸附树脂洗脱至少一部分剩余的被吸 附糖苷，其中后续洗脱溶剂包含约36-100%w/w的乙醇和约0-64%w/w的 水，并且用后续洗脱溶剂洗脱的组合物富集reb-A和reb-B。

在本发明其他的特别方面，衍生自甜叶菊的糖苷溶液的pH可以是非常 酸性的pH。在这些实施方案中，pH经调节的衍生自甜叶菊的糖苷溶液的 pH可以为约1至约4。在其他实施方案中，pH经调节的衍生自甜叶菊的糖 苷溶液的pH可以为约1至约3。在这些实施方案的一些中，至少一种洗脱 溶剂包含约40-65%w/w的乙醇和约35-60%w/w的水。在其他的实施方案 中，至少一种洗脱溶剂包含约40-60%w/w的乙醇和约40-60%w/w的水。 在这些实施方案中，富集至少一种糖苷的组合物富集reb-A和reb-D。在这 些实施方案的一些中，用后续洗脱溶剂从大孔中性吸附树脂洗脱至少一部 分剩余的被吸附糖苷，其中后续洗脱溶剂包含约61-100%w/w的乙醇和约 0-39%w/w的水，并且用后续洗脱溶剂洗脱的组合物富集reb-B。

在本发明的实施方案中，大孔中性吸附树脂包括二乙烯基苯大孔树脂。 本发明还涉及根据本发明描述的方法制备的经富集的组合物。

附图说明

图1A和图1B显示了“新蛇菊苷B”和“新蛇菊苷D”的结构。

图2为实施例1中每种洗脱的各种糖苷的回收图。

图3为实施例2中在不同乙醇浓度下洗脱的样品的糖苷曲线图。

图4为实施例3中进样过程中从柱上洗脱的糖苷浓度图。

图5为实施例3中用15%的乙醇冲洗和用100%的乙醇洗脱过程中从柱 上洗脱的糖苷浓度图。

图6为实施例4中进样、冲洗和洗脱过程中的糖苷浓度图。

图7显示了实施例4中洗脱过程中收集的新蛇菊苷A、甜菊苷、新蛇 菊苷B和新蛇菊苷D的质量(mass)。

图8为实施例5中进样、冲洗和洗脱过程中的糖苷浓度图。

图9显示了实施例5中洗脱过程中收集的新蛇菊苷A、甜菊苷、新蛇 菊苷B和新蛇菊苷D的量。

具体实施方式

Reb-B和reb-D具有理想的感官特性。例如，reb-B比reb-A的苦味更 少且具有稍微较少的甜味。纯粹的组分感官数据显示了reb-B中苦味的降 低，其表明reb-B和reb-A的混合物可具有较少的苦味。与有显著降低苦味 的reb-A相比，Reb-D具有类似或更强烈的甜味。由于reb-D和reb-B降低 的苦味，预计reb-D、reb-B和reb-A的混合物会具有改善的味道。

本发明提供了富集reb-B和/或reb-D的方法，以利用甜味剂组合物中 的理想特性。

本发明方法还可以用于通过使用该工艺而从包含reb-A的组合物中去 除至少一部分reb-B和/或reb-D，产生包含reb-A的经富集的组合物。

在本发明方法中，衍生自甜叶菊的糖苷溶液可以是从甜叶菊叶提取物 制备的溶液，或者衍生自甜叶菊的糖苷溶液可以是结晶工艺的母液。在一 些实施方案中，当期待多个富集步骤时，衍生自甜叶菊的糖苷溶液可以是 本发明富集工艺的产物。可以存在于衍生自甜叶菊的糖苷溶液中的糖苷的 实例包括reb-A、reb-B、reb-C、reb-D、reb-F、甜菊苷、杜尔可苷-A (dulcoside-A)、甜菊双糖苷和覆盆子苷。

在一些实施方案中，在本发明方法中用作原料的衍生自甜叶菊的糖苷 溶液包含浸渍水(steep water)，该浸渍水通过以约10：1的水对叶子的比率 至约100：1的水对叶子的比率，更通常为约20：1至约50：1将甜叶菊叶 浸渍在水中而制备。浸渍通常进行约1至约24小时，更通常为约2小时。 浸渍水通常含有约0.1至约5.0重量%的固体，更通常约1至约2重量%的 固体。浸渍水还可以以逆流或并流提取通过多次叶提取而制备，以改进衍 生自甜叶菊的糖苷的回收。

存在于浸渍水中的固体通常为约15至约30重量%的糖苷，更通常约 20重量%至约25重量%的糖苷。存在的糖苷根据甜叶菊叶的种类而变化。 通常，reb-A和甜菊苷占所存在糖苷的约50%至约80%，reb-A对甜菊苷的 比率为约4：1至约1：4，更通常约2：1至约1：2。

在一些实施方案中，衍生自甜叶菊的糖苷溶液可以在吸附之前浓缩。 该溶液可浓缩至10-50重量%的固体，更通常为20-40%(g固体/100g溶液)。

在一些实施方案中，在本发明方法中用作原料的衍生自甜叶菊的糖苷 溶液包含主体量的reb-A和一种或多种选自reb-B和reb-D的杂质。通常， 不纯的reb-A组合物中reb-B和reb-D的总量可以变化为至多约6重量%。 例如，在一些实施方案中，不纯的reb-A组合物包含约90重量%至约96 重量%的reb-A；约1重量%至4重量%的reb-B；和约1重量%至约4重量 %的reb-D。

在一些实施方案中，在本发明方法中用作原料的衍生自甜叶菊的糖苷 溶液包含从甜叶菊叶部分纯化的提取物，其含有约10重量%至约90重量% 的reb-A；约0重量%至约40重量%的甜菊苷；约0重量%至约5重量%的 reb-B；和约0重量%至约5重量%的reb-D。在其他的实施方案中，衍生自 甜叶菊的糖苷溶液包含约80重量%的甜菊醇糖苷(steviol glycoside)；约40 重量%至约80重量%的reb-A；约20至约40重量%的甜菊苷；约1至约5 重量%的reb-B，和约1至约5重量%的reb-D。

在许多实施方案中，衍生自甜叶菊的糖苷溶液包含溶剂。对于衍生自 甜叶菊的糖苷溶液的溶剂组合物通常包括水、或低级醇(如C₁-C₃醇)与水的 混合物。低级醇的实例包括甲醇、乙醇和丙醇(如正丙醇和异丙醇)。也可以 使用两种或更多种醇与水的混合物。在许多实施方案中，溶剂组合物仅包 含水。在其他的实施方案中，基于溶剂组合物总重，溶剂组合物包含约5 重量%至约30重量%的低级醇和约95重量%至约70重量%的水。更通常 地，溶剂组合物包含5重量%至约20重量%的低级醇和约95重量%至约80 重量%的水。

衍生自甜叶菊的糖苷溶液通常包含约1重量%至约20重量%的溶解固 体和约99重量%至约80重量%的溶剂。在一些实施方案中，衍生自甜叶菊 的糖苷溶液包含约2重量%至约5重量%的溶解固体和约98重量%至约95 重量%的溶剂。

在本发明方法中，固定相吸附剂包括大孔中性吸附树脂。可用的固定 相吸附剂包括二乙烯基苯大孔树脂，如以“SP70”、 “SP710”、“SP825”、“SP850”、 “DIAION^TMHP20”和“DIAION^TMHP21”(购自Mitsubishi)和“AMBERLITE^TM  FPX66”(购自Dow)的商品名市售的那些树脂。SP70被报导具有800m²/g的 表面积、70埃的孔半径和0.45mm的平均粒径。FPX66被描述为具有700m²/g 表面积和0.6至0.75mm粒径的大孔芳族聚合物。

在一些实施方案中，有利的是将衍生自甜叶菊的糖苷溶液的pH调节为 约7至约11的pH。在其他的实施方案中，衍生自甜叶菊的糖苷溶液的pH 可调节为约8至约11的pH。在另外其他的实施方案中，衍生自甜叶菊的 糖苷溶液的pH可调节至约8至约10的pH。在另外其他的实施方案中，衍 生自甜叶菊的糖苷溶液的pH可调节至约9。pH通常通过加入碱来调节。 可用的碱包括氢氧化钠、氢氧化钾、氧化钙(石灰)或氢氧化钙。

在其他的实施方案中，衍生自甜叶菊的糖苷溶液的pH可调节为约4 至约7。在另外其他的实施方案中，衍生自甜叶菊的糖苷溶液的pH可调节 为约5至约6。在另外其他的实施方案中，衍生自甜叶菊的糖苷溶液的pH 可调节为约1至约4。在另外其他的实施方案中，衍生自甜叶菊的糖苷溶液 的pH可调节为约1至约3。在另外其他的实施方案中，衍生自甜叶菊的糖 苷溶液的pH可调节至约2。

对pH的调节可用于改变吸附树脂对reb-B的结合特性。例如，增大pH 可以将reb-B从与吸附树脂的强结合改变为与吸附树脂的弱结合。pH的降 低可以使得reb-B与树脂强结合。通过调节pH，可以改变reb-B的洗脱性 质，以提供理想的富集曲线。以下提供reb-B对各种吸附树脂的结合性质 的归纳

将衍生自甜叶菊的糖苷溶液加至吸附树脂上之后，随后将一种或多种 洗脱溶剂加入通过吸附床以洗脱一种或多种经富集部分(fraction)。在许多 实施方案中，配制洗脱溶剂以使至少一部分被吸附的reb-B和/或reb-D从 吸附剂释放并从床上洗脱。用于洗脱reb-B和/或reb-D的可用的洗脱溶剂 包括例如C₁-C₃醇/水溶液(如乙醇/水溶液)。

本发明富集方法可用于制备包含reb-B、reb-D或reb-B和reb-D两者的 经富集的组合物。此外，该方法可以用于从reb-A组合物中去除reb-B和/ 或reb-D，从而增加reb-A的相对纯度。如本文中使用的，术语“经富集的” 意为相比起始组合物中存在的其他糖苷，基于干固体的经富集组分的量的 增加。例如，在经富集的组合物中，相对被用作富集工艺的起始组合物的 衍生自甜叶菊的糖苷组合物中存在的量，基于干固体的reb-B、reb-D或两 者的量增加。例如，在一些实施方案中，经纯化的reb-B和/或reb-D溶液 可以包含基于糖苷的约25至约90重量%的reb-A、约10至约50重量%的 reb-D；以及0至约2重量%的reb-B。在其他的实施方案中，经纯化的reb-B 和/或reb-D溶液包含基于糖苷的约25至约60重量%的reb-A、约10至约 50重量%的reb-D；以及5至约2重量%的reb-B。

在本发明的一些实施方案中，可以进行多次富集工艺以增加经富集的 组合物的最终纯度。例如，第一次分离而来的经富集的组合物可以加至第 二色谱床中以进一步富集该组合物中的reb-B、reb-D或它们的混合物。

由各种比率的乙醇和水组成的洗脱溶剂可用于优选地洗脱富集reb-B、 reb-D或reb-B和reb-D组合的组合物。申请人出人意料地发现，与仔细调 节衍生自甜叶菊的糖苷溶液的pH相结合，洗脱溶剂中乙醇和水比率的微小 改变即可洗脱富集reb-B、reb-D或它们的组合的组合物。

Reb-B和Reb-D的富集

在某些实施方案中，reb-B和reb-D可被优选地洗脱。在这些实施方案 中，衍生自甜叶菊的糖苷溶液的pH可以是约7至约11。在其他的实施方 案中，衍生自甜叶菊的糖苷溶液的pH可调节为约8至约11。在另外的其 他实施方案中，衍生自甜叶菊的糖苷溶液的pH可调节为约8至约10。在 另外的其他实施方案中，衍生自甜叶菊的糖苷溶液的pH可调节至约9。

仔细调节pH之后，可以通过洗脱溶剂的乙醇/水比率的调节来优选洗 脱reb-B和reb-D。在一个示例性的实施方案中，可以使用含约10-50%w/w 的乙醇和约50-90%w/w的水的溶剂来优选洗脱reb-B和reb-D。在其他的 实施方案中，洗脱溶剂含约10-40%w/w的乙醇和约60-90%w/w的水。在 另外的其他实施方案中，洗脱溶剂含约20-35%w/w的乙醇和约65-80%w/w 的水。在另外的其他实施方案中，洗脱溶剂含约25-33%w/w的乙醇和约 67-75%w/w的水。通常，洗脱溶剂对糖苷溶液的重量比率为约20:1至 1:100(洗脱溶剂份数：糖苷溶液份数)，更通常为约10:1至1:20(洗脱溶剂份 数：糖苷溶液份数)。溶剂比率很大程度取决于含糖苷溶液中糖苷的浓度。

在洗脱富集reb-B和reb-D的组合物之后，使用适合的后续洗脱溶剂可 将剩余的被吸附的糖苷从树脂上脱附。相比用于优选洗脱reb-B和reb-D的 溶剂，该后续洗脱溶剂由百分比更大的乙醇组成。用该后续洗脱溶剂洗脱 的组合物可富集reb-A。在一些实施方案中，该后续洗脱溶剂含约36-100% w/w的乙醇和约0-64%w/w的水。该后续洗脱溶剂还可含例如约40-80% w/w的乙醇和约20-60%的水。

Reb-D的富集

在其他的某些实施方案中，reb-D可以被优选地洗脱。在这些实施方案 中，衍生自甜叶菊的糖苷溶液的pH可以是约4至约7。在其他实施方案中， 衍生自甜叶菊的糖苷溶液的pH可调节为约5至约7。在另外的其他实施方 案中，衍生自甜叶菊的糖苷溶液的pH可调节为约5至约6。在仔细调节pH 之后，可以通过洗脱溶剂乙醇/水比率的调节来优选洗脱reb-D。在一些实 施方案中，洗脱溶剂含约10-40%w/w的乙醇和约60-90%w/w的水。在其 他实施方案中，洗脱溶剂含约20-35%w/w的乙醇和约65-80%w/w的水。 在另外的其他实施方案中，洗脱溶剂含约25-33%w/w的乙醇和约67-75% w/w的水。在洗脱富集reb-D的组合物之后，使用适合的后续洗脱溶剂可 将剩余的被吸附糖苷从树脂上脱附。相比用于优选洗脱reb-D的溶剂，该 后续洗脱溶剂由百分比更大的乙醇组成。用该后续洗脱溶剂洗脱的组合物 可富集reb-A和reb-B。在一些实施方案中，该后续洗脱溶剂含约36-100% w/w的乙醇和约0-64%w/w的水。该后续洗脱溶剂还可含例如约40-80% w/w的乙醇和约20-60%的水。

Reb-B的富集

在某些其它的实施方案中，可以获得富集reb-B的组合物。这些实施 方案可以使用一系列的洗脱。在这些实施方案中，衍生自甜叶菊的糖苷溶 液的pH可以为约1至约4。在其他的实施方案中，衍生自甜叶菊的糖苷溶 液的pH可调节为约1至约3。在另外的其他实施方案中，衍生自甜叶菊的 糖苷溶液的pH可调节至约2。在这些实施方案中，选择衍生自甜叶菊的糖 苷溶液的pH，以使得reb-B非常强地与树脂结合。

在这些实施方案中，大部分的衍生自甜叶菊的糖苷被首先洗脱。在一 些实施方案中，洗脱溶剂含约30-70%w/w的乙醇和约30-70%w/w的水。 在其他的实施方案中，洗脱溶剂含约40-60%w/w的乙醇和约40-60%w/w 的水。在另外的其他实施方案中，洗脱溶剂含约45-55%w/w的乙醇和约 45-55%w/w的水。该经洗脱的组合物富集reb-A和reb-D。在洗脱该富集 reb-A和reb-D的组合物之后，可以使用适合的后续洗脱溶剂然后将富集 reb-B的组合物从树脂上脱附。相比用于洗脱富集reb-A和reb-D的组合物 的溶剂，该后续洗脱溶剂由百分比更大的乙醇组成。在一些实施方案中， 后续洗脱溶剂含约60-100%w/w的乙醇和约0-40%w/w的水。在一些实施 方案中，后续洗脱溶剂含约70-100%w/w的乙醇和约0-30%w/w的水。用 该后续洗脱溶剂洗脱的组合物可富集reb-B。

在调节pH以使reb-B非常强地与树脂结合的本发明的实施方案中，使 用多次洗脱以及每次洗脱中乙醇/水比率的仔细调节，可使富集reb-D、reb-A 和reb-B的组合物被单独洗脱。在该实施方案中，reb-D可以首先从柱上洗 脱。在一些实施方案中，洗脱富集reb-D的组合物的洗脱溶剂含约10-40% w/w的乙醇和约60-90%w/w的水。在其他的实施方案中，洗脱富集reb-D 的组合物的洗脱溶剂含约20-35%w/w的乙醇和约65-80%w/w的水。在另 外其他的实施方案中，洗脱富集reb-D的组合物的洗脱溶剂含约25-33% w/w的乙醇和约67-75%w/w的水。

在洗脱富集reb-D的组合物后，然后使用适合的后续洗脱溶剂来洗脱 富集reb-A的组合物。在一些实施方案中，该后续洗脱溶剂含约40-60%w/w 的乙醇和约40-60%w/w的水。在其他实施方案中，该后续洗脱溶剂含约 45-55%w/w的乙醇和约45-55%w/w的水。

在洗脱富集reb-A的组合物后，然后使用适合的进一步后续的洗脱溶 剂洗脱富集reb-B的组合物。在一些实施方案中，该进一步后续的洗脱溶 剂含约60-100%w/w的乙醇和约0-40%w/w的水。在其他的实施方案中， 该进一步后续的洗脱溶剂含约65-90%w/w的乙醇和约10-35%w/w的水。 在另外的其他实施方案中，该进一步后续的洗脱溶剂含约70-85%w/w的乙 醇和约15-30%w/w的水。

从本发明得到的reb-D富集部分可基于糖苷包含约10重量%至约50 重量%的reb-D，并且基本上不含reb-B。从本发明得到的reb-B富集部分可 基于糖苷包含约1重量%至约5重量%的reb-B，并且基本上不含reb-D。

现将参考以下的非限制性实施例描述本发明。

实施例

实施例中使用以下缩写。

RD或reb-D：新蛇菊苷-D

RA或reb-A：新蛇菊苷-A

Stv：甜菊苷

RC或Reb-C：新蛇菊苷-C

RF或Reb-F：新蛇菊苷-F

RB或Reb-B：新蛇菊苷-B

SB：甜菊双糖苷

208：新蛇菊苷-A的异构体

SP710：Diaion Sepabead SP710

EtOH：乙醇

实施例1

用室温水提取甜菊叶，获得具有0.58%的溶解固体和pH5.8的提取物。 将370ml体积的浸渍水通过填充SP710树脂、并保持在50℃的25ml的柱 子。用148ml的水进一步冲洗柱。合并在进样和初始水冲洗过程中通过的 物料用于分析，并将其记为通过部分。连续用50ml的乙醇浓度增大的20 至60%(w/w)的乙醇和40至80%(w/w)的水洗脱该柱，并在每次乙醇洗脱之 间用35ml水漂洗。收集每次的漂洗水和在每个不同浓度下的乙醇洗脱液， 混合并干燥用于分析。图2是对于每次洗脱的各糖苷的回收。约50%的质 量没有吸附在柱上，而在被吸附的质量中，其大多数被浓度为40%(w/w) 的乙醇和60%(w/w)的水从柱子洗脱。Reb-D在reb-A和甜菊苷之前用最高 约30%浓度的乙醇的洗脱出柱子。

相比初始的叶提取物，30%(w/w)的乙醇和70%(w/w)的水所洗脱的部分 富集reb-D。

申请人注意到尽管本实施例和其他实施例在升高的温度下进行，但本 文描述的方法也可以在环境温度下进行。

实施例2

用室温水提取甜菊叶，用氯化铁和石灰对其进行处理，并过滤以产生 具有0.79%的固体和pH9.5的浸渍水。将400ml的体积以1.6个床体积/小 时(BV/hr)通过保持在50℃的25ml SP710柱。用75ml的水冲洗柱，并与在 初始进样过程中通过柱的物料合并，并将其记为通过部分。用50ml的乙 醇和水的浓度增大的20至70%(w/w)的乙醇和30至80%(w/w)的水，将甜 叶菊糖苷洗脱出柱。每次乙醇洗脱之间使用50ml水漂洗柱，并在干燥前将 漂洗水与每个浓度的乙醇部分合并。图3是不同乙醇浓度下洗脱样品的糖 苷曲线。在该pH下，reb-D、reb-B和甜菊双糖苷在大部分reb-A和甜菊苷 之前用30%(w/w)的乙醇和70%(w/w)的水首先洗脱出柱。

相比进料，30%(w/w)的乙醇和70%(w/w)的水洗脱的部分富集了reb-D、 reb-B和甜菊双糖苷。

实施例3

将填充有SP70树脂的150ml玻璃柱用2个床体积的15重量%的乙醇 /85重量%的水溶液平衡。使用15重量%的乙醇/85重量%的水溶液以及含 83.9%的reb-A、2.1%的reb-D、4.0%的reb-B和1.6%的甜菊苷的甜叶菊提 取物批料制备2重量%的溶液。该溶液以约18.5个床体积通过柱，随后用 15重量%的乙醇/85重量%的水溶液洗脱2个床体积，并用100重量%的乙 醇脱附3个床体积。进样、洗脱和脱附在55℃下以2BV/hr的流速进行。将 物料收集于约50ml样品中，在真空烘箱中80℃下干燥，并通过HPLC分 析，以鉴定每个样品中的糖苷浓度。

图4是进样过程中从柱洗脱的糖苷浓度。图5是用15%的乙醇/85重量 %的水溶液冲洗和以100%乙醇洗脱过程中从柱子洗脱的糖苷浓度。通过分 离10-15个BV流出物，物料会富集RD。经合并的提取物可具有以下组成：

实施例4

将填充有SP70树脂的160ml柱用水平衡，随后进样1440ml的每100g 含5g甜叶菊提取物的水溶液，并通过加入柠檬酸将pH调节至2.0。将保持 在55℃下的柱以2.5BV/hr进样。然后最初用1.5个BV的水冲洗柱，随后 用从0%乙醇开始至100%乙醇结束的乙醇线性梯度洗脱4个BV。最后用 100%的乙醇将柱洗脱0.5个BV。甜叶菊提取物包含45.6%的RA、31.8% 的Stev、1.3%的RF、9.4%的RC、1.5的RD、2.1%的RB、0.8%的杜克苷 A和1.3%的甜菊双糖苷。图6为进样、冲洗和洗脱过程中的糖苷浓度。图 7显示了洗脱过程中收集的RA、Stev、RB和RD的质量。RD首先用30%(w/w) 的乙醇和70%(w/w)的水洗脱；RA和Stev用50%(w/w)的乙醇和50%(w/w) 的水洗脱；而RB用70%(w/w)的乙醇和30%(w/w)的水洗脱。收集30%的 乙醇洗脱液、50%的乙醇洗脱液和70%的乙醇洗脱液分别可使提取物分离 为RD富集的、RA/Stev富集的和RB富集的料流。可选地，收集进样过程 中穿透柱的3.5-5.5个BV的糖苷而得到RB和RD富集的产物。

实施例5

将填充有SP70树脂的120ml柱用水平衡，随后进样1025ml的每100g 含5g甜叶菊提取物的水溶液，并通过加入氢氧化钾将pH调节至9.0。将保 持在55℃下的柱子以2.5BV/hr进样。然后最初用1.5个BV的水冲洗柱， 随后用从0%乙醇开始至100%乙醇结束的乙醇线性梯度洗脱4个BV。最 后，最后用100%的乙醇将柱洗脱4个BV。甜叶菊提取物包含45.6%的RA、 31.8%的Stev、1.3%的RF、9.4%的RC、1.5的RD、2.1%的RB、0.8%的杜 克苷A和1.3%的甜菊双糖苷。图8为进样、冲洗和洗脱过程中的糖苷浓度。 图9显示了洗脱过程中收集的RA、Stev、RB和RD的质量。RB和RD首 先用30%(w/w)的乙醇和70%(w/w)的水洗脱；RA和Stev用50%(w/w)乙醇 和50%(w/w)水洗脱；收集30%的乙醇洗脱液和50%的乙醇洗脱液，分别可 使提取物分离为RB/RD富集和RA/Stev富集的料流。

考虑本说明书或从本文公开的发明实践，本发明的其他实施方案对于 本领域技术人员是显而易见的。本领域技术人员可以做出对本发明所描述 原理和实施方案的各种省略、修改和变化而不背离以下权利要求所表示的 本发明真实的范围和精神。