一株鸡新城疫病毒株H12株及其在制备鸡新城疫弱毒活疫苗中的应用

技术领域

本发明涉及一株鸡新城疫病毒株及其应用，具体涉及鸡新城疫病毒株H12株 及其在制备预防或治疗鸡新城疫生物制剂中的应用，属于生物技术领域。

背景技术

新城疫（newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus， NDV）引起的一种急性、高度接触性禽类传染病，是当今全球范围内重要的家禽 传染病之一。在临床上该病常呈败血症经过，主要特征是呼吸困难、下痢、神经机 能紊乱、黏膜和浆膜出血。该病发病急、致死率高，对养禽业的发展构成了严重威 胁，因此被世界动物卫生组织（OIE）定为A类传染病，我国也将其列为一类动物 疫病。

目前，该病已广泛流行于我国所有养鸡地区，在家禽病毒病中，它的流行和危 害性占首位。据农业部估计，我国每年因各种禽病造成的经济损失高达数十亿元， 其中NDV占了近10%。

NDV只有1个血清型，但根据其毒力的不同，可以分为强毒株、中等毒力株 和弱毒株（低致病力毒株）。强毒株又可称为速发型毒株，中等毒力株为中发型毒 株，弱毒株为缓发型毒株。

尽管我国新城疫免疫接种已经普及多年并己基本上控制了典型新城疫的流行， 但非典型ND仍时有发生，严重威胁着养鸡业的健康发展。目前疫苗是控制本病发 生的重要手段。

自从1940开始，就在全球范围内使用新城疫疫苗，最为成功的疫苗是由缓发 型病毒株和经过精心筛选的某些中发型病毒株组成的新城疫活病毒疫苗。

在我国，使用弱毒活疫苗和油乳剂灭活疫苗已成为防治新城疫的常规实践。

灭活苗自70年开始应用，分单纯灭活苗和油乳剂灭活苗，目前应用较多的是 油乳剂灭活苗。油乳剂灭活苗可以产生坚强而持久的免疫力，不会通过疫苗的使用 而扩散病原。

弱毒疫苗株包括中等毒力的I系疫苗（Mukteswar株）以及弱毒的Ⅱ系、Ⅲ系、 Ⅳ系和V4弱毒疫苗。

最近几年，随着细胞培养技术的发展，细胞苗和克隆苗相继问世。克隆苗具有 抗原性纯一，免疫原性强的特点。我国从美国引进的克隆N-79株型La Sota弱毒 株，从I系中挑选出的克隆-30及克隆-83是具有良好免疫原性而且遗传性非常稳定 的弱毒疫苗。

细胞苗具有成本低、容易生产和可避免鸡源性潜在疾病感染的特点。

成纤维细胞是结缔组织最主要的细胞成分，它是由胚胎时期的间充质细胞分化 而来，在分泌细胞外基质成分和构建细胞外基质中扮演着十分重要的角色，在组织 创伤修复过程中也发挥着重要的作用。由于鸡胚成纤维细胞相对容易获得，而且增 殖能力强，适应性强，具有良好的耐受性，性状比较稳定，不易发生转化。因此， 使得成纤维细胞除了应用于细胞和分子生物学的研究，还被广泛应用于病毒学研究 领域，同时也是疫苗生产的重要细胞资源。

但目前市售的鸡新城疫活疫苗绝大部分来源于鸡胚组织苗，因为利用现有的鸡 胚成纤维细胞生产工艺所生产的原液，病毒滴度不稳定，批间差异较大。

发明内容

本发明所要解决的技术问题之一是提供一种低致病力的鸡新城疫病毒，该病毒 具有免疫原性好，安全，且同时具有在细胞上增殖的特性，从而适宜作为大规模生 产弱毒疫苗的种毒。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

2012年，本发明发明人从黑龙江省齐齐哈尔市郊某养殖场，采集濒死鸡肝脏， 研磨后用2000单位青、链霉素溶液处理，再接种鸡胚，收集48h～96h鸡胚尿囊液， 分离了一株低致病力的鸡新城疫病毒，其具有在细胞上增殖的特性。基于此，本发 明通过利用病毒驯化与纯化技术，筛选出了在鸡胚成纤维细胞上增殖力良好的低致 病力的病毒株，研究表明该病毒株具有滴度高、免疫原性好、安全性好等优点。

本发明分离得到低致病力的鸡新城疫病毒，命名为H12株，分类命名为鸡新 城疫病毒，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北 京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，微生物保藏号为CGMCC No.8506； 保藏日期：2013年11月18日。

本发明还提出了所述的低致病力的鸡新城疫病毒在制备鸡新城疫弱毒活疫苗 中的应用。

本发明所要解决的技术问题之二是提供一种制备鸡新城疫弱毒活疫苗的方法。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

一种制备鸡新城疫弱毒活疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）将保藏号为CGMCC No.8506的H12株用无血清DMEM稀释10⁴倍后， 接种单层鸡胚成纤维细胞，至37℃培养，当细胞80%出现病变时，至-20℃冻融3 次后，收获用于疫苗制备.

（2）冻干

向收获的细胞原液内加入相同体积的冻干保护剂，混匀、定量、冻干；

（3）压盖、轧盖

冻干完成后，抽真空、压紧胶塞，并用铝盖轧紧密封，-20℃冻存，即得。

本发明的制备得到的一种鸡新城疫弱毒活疫苗，其特征在于有效成分为本发明 所述的低致病力的鸡新城疫病毒。

优选的，所述的冻干保护剂为5%蔗糖脱脂乳（蔗糖5g+脱脂乳至100ml）。

实验表明，本发明分离得到的NDV H12株是一株免疫原性好、生产性能优良、 适宜大规模生产的种毒。由该NDV H12株制备的活疫苗产品质量合格，具备产业 化生产的条件。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述 而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域 技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的 细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1本发明鸡新城疫病毒株种毒的分离、培养及鉴定

一、病料采集及微量红细胞凝集（HA）试验

病料来自黑龙江省齐齐哈尔市郊某养殖场，采集濒死鸡肝脏，研磨后用2000 单位青、链霉素溶液处理，再接种鸡胚，收集48h～96h鸡胚尿囊液。对收获的鸡胚 液进行血凝试验，微量红细胞凝集（HA）试验的具体操作步骤如下：

1、向微量血凝板每孔中加入PBS25μl，共做4行平行重复。

2、吸取鸡胚液加入到第1列各孔，每孔25μl，然后自左向右进行2倍系列稀 释至第11列孔，从第11列各孔吸取25μl混合液，弃去。第12列各孔不加抗原， 作为对照孔。

3、向每孔中加入1%红细胞悬液25μl。

4、将微量血凝板置微型震荡器上震荡1分钟。

5、将微量血凝板置室温作用30分钟，判定结果。

结果表明，收获的鸡胚液的HA血凝价为7log₂。

二、病毒分离株血凝抑制（HI）试验

分别用H5、H7和H9亚型AI标准阳性血清及ND、EDS-76病毒标准阳性血 清与HA为阳性的鸡胚尿囊液进行HI试验。

微量血凝抑制（HI）试验的具体操作步骤如下

1、在96孔微量板上，第1孔至第12孔，每孔加入25μl PBS。

2、向第1孔中加入被检血清25μl，依次2倍系列稀释至第12孔，最后从第 12孔弃去25μl混合液。

3、向每孔中加入25μl4倍的HA单位工作抗原液，置微型震荡器上震荡1分 钟。

4、置室温下作用30分钟。

5、向每孔加入1%红细胞悬液25μl，置微型震荡器上震荡1分钟。

6、置室温作用30分钟，判定结果。

结果表明，与H5、H9、H7亚型AI和EDS-76病毒标准阳性血清反应为阴性， 与ND标准阳性血清反应为阳性。

三、F1代原始种毒脑内致病指数（ICPI）和静脉接种致病指数（IVPI）的测 定

1、脑内致病指数（ICPI）的测定

取1日龄SPF雏鸡10只，各脑内注射10^-1稀释的新鲜含F1代原始种毒的尿 囊液（接种针头直径0.45mm，长5mm）。另取2只以同样方法注射稀释病毒用的 生理盐水各0.05ml。

接种后，每日在相应接种的时间观察，记录雏鸡的情况，分正常、（活动灵活， 行动无共济失调现象）、发病（包括麻痹、卧地不起，但不包括只表现迟钝的鸡） 和死亡。观察8日，计算正常、发病、死亡鸡的总数，根据不同的权值（正常为0， 发病为1，死亡为2）累计总分数。ICPI为累计总分除以正常、发病和死亡鸡的累 计总数的平均值。统计结果如表1所示：

表1脑内致病指数测定表

从上表数据计算得出：ICPI=9/80=0.1125。根据国际通用的标准，可判定F1 代原始种毒为低等致病力的病毒株。

2、静脉致病指数（IVPI）的测定

取6周龄SPF鸡10只，静脉接种10^-1稀释的含F1代原始种毒尿囊液0.1ml， 另取2只接种生理盐水做对照。每日在接种的相应时间观察，记录接种鸡情况，分 正常、发病（鸡只卷缩在一起不愿运动，不愿采食或饮水，但无明显的翅、腿麻痹 表现）、麻痹（翅、腿明显不协调，翅膀下垂）和死亡。观察10日后，累计正常、 发病、麻痹和死亡动物数，根据不同权值（正常为0，发病为1，麻痹为2，死亡 为3）累计总分数。IVPI为累计总分除以正常、发病、麻痹和死亡动物的累计总数。 统计结果如表2所示：

表2静脉致病指数测定表

从上表数据计算得出：IPVI=126/100=1.26。可判定本发明得到的F1代原始种 毒为低等致病力的病毒株。

四、病毒在鸡胚上的传代

将收获的病毒液，在鸡胚盲传5代，得到F5代鸡胚毒。

五、病毒在细胞上的传代

1、细胞的制备

取10日龄SPF鸡胚，去除头、四肢和内脏，剪碎。PBS洗3遍，用0.25% 胰酶消化10min，再用吸管将细胞轻轻吹打均匀，加入含10%犊牛血清的DMEM至 37℃培养，待细胞长成单层后即可使用。

2、接种

用PBS将长成单层的鸡胚成纤维细胞（CEF）清洗3遍，接种1000倍稀释的 F5代鸡胚毒，37℃吸附1小时后，加入含2%犊牛血清的DMEM，至37℃培养， 待细胞80%出现病变后，收获细胞毒，得到F6代细胞毒。按照此步骤进行传代15 次，得到F17-F20代细胞毒。

六、病毒在CEF上的筛选

将细胞毒按适当的稀释度稀释，接种于6孔板上生长良好的CEF单层细胞， 其中一孔为正常细胞对照，铺上1%低熔点琼脂糖，37℃5%CO₂条件下培养4天。 用0.01%的中性红染色，挑取界限清晰、直径较大噬斑于DMEM培养液中。按照 此步骤传代30次，得到F21-F50代细胞毒。

七、种毒的扩增

将筛选的F50代种毒用无血清DMEM稀释10⁴倍后，接种单层CEF，至37℃ 培养。当细胞80%出现病变时，至-20℃冻融3次后，收获后得F51代。

八、H12株的保藏

获得的第51代种毒，为适应细胞培养的低致病力的鸡新城疫病毒，命名为H12 株，分类命名为鸡新城疫病毒，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心；保藏地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，微生物保藏号 为CGMCC No.8506；保藏日期：2013年11月18日。

实施例2关键代次病毒研究

1、关键代次病毒的红细胞凝集价（HA）的测定

方法与实施例1中的“微量红细胞凝集（HA）试验”的测定方法相同。结果 如下表3所示：

表3关键代次种毒红细胞凝集价（HA）的测定

2、关键代次种毒病毒含量的测定（ELD₅₀）

将各代次毒种用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取适合的稀释度，每个稀释 度各尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5个，每胚0.1ml，置36～37℃继续孵育，观 察24～72小时，记录死亡情况，死亡胎儿有明显病痕，同一稀释度的死胚胚液等 量混合，测定鸡红细胞凝集价，在1:64～1:512认为感染，计算病毒含量（ELD₅₀）， 结果如下表4所示：

表4关键代次种毒病毒含量的测定（ELD₅₀/0.1ml）

3、传代病毒的脑内致病指数（ICPI）和静脉接种致病指数（IVPI）的测定

将各代次毒种用无血清DMEM分别稀释10⁴倍后，接种单层CEF，至37℃培 养。当细胞80%出现病变时，至-20℃冻融3次后，收获。测定关键代次的脑内致 病指数（ICPI）和静脉接种致病指数（IVPI），方法如实施例1中所述，结果如表 5所示：

表5关键代次种毒脑内致病指数（ICPI）和静脉接种致病指数（IVPI）的测定

4、关键代次种毒安全性试验

4.1对2～8月龄SPF鸡的安全性

种毒100倍稀释，肌肉注射2～8月龄SPF鸡4只，每只1ml，观察15日。

4.2对2～7日龄SPF鸡的安全性

用2～7日龄SPF雏鸡20只，分成两组，第一组10只，每只滴鼻接种5倍稀 释的含毒胚液0.05ml；第二组10只，不接种作为对照，两组在同条件下分别饲养 管理，观察10日。结果如表6所示：

表6关键代次种毒安全性试验结果

注：健活数/接种数

实施例3关键代次活疫苗血清HI抗体以及疫苗攻毒保护率的测定

1、鸡新城弱毒活疫苗的制备

1.1原液的制备

将各代次毒株分别用无血清DMEM稀释10⁴倍后，接种单层CEF，至37℃培 养。当细胞80%出现病变时，至-20℃冻融3次后，收获。

1.2冻干

向收获的细胞原液内加入相同体积的5%蔗糖脱脂乳（蔗糖5g+脱脂乳至 100ml），混匀、定量、冻干。

1.3压盖、轧盖

冻干完成后，抽真空、压紧胶塞，并用铝盖轧紧密封，-20℃冻存。

2、免疫攻毒试验

用2～8月龄SPF鸡4只，各肌肉注射制备得到含有各代次种毒的疫苗1ml（含 10^5.0ELD₅₀），10～14日后，与同条件饲养的未免疫对照鸡3只同时注射10^5.0ELD₅₀的鸡新城疫北京株强毒1ml，观察10～14日，记录发病和死亡情况，同时对免疫 鸡血清HI抗体进行了测定，结果如下表7和表8所示：

表7关键代次活疫苗血清HI抗体的测定

表8关键代次疫苗攻毒保护率的测定

实施例4鸡新城弱毒活疫苗的制备及免疫效力分析

为了验证细胞驯化毒的特性，用筛选的第51代种毒（CGMCC No.8506），用 相同的方法，分别制备了10批次疫苗，并测定了相关技术指标，具体说明如下。

一、鸡新城弱毒活疫苗的制备

1、原液的制备

将筛选的H12株（第51代种毒，CGMCC No.8506）用无血清DMEM稀释10⁴倍后，接种单层CEF，至37℃培养。当细胞80%出现病变时，至-20℃冻融3次后， 收获。采用实施例1相同的方法对红细胞凝集价（HA）进行了测定，结果如下表 9所示：

表9半成品红细胞凝集价（HA）的测定

将毒种用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取适合的稀释度，每个稀释度各尿 囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5个，每胚0.1ml，置36～37℃继续孵育，观察24～ 72小时，记录死亡情况，死亡胎儿有明显病痕，同一稀释度的死胚胚液等量混合， 测定鸡红细胞凝集价，在1:64～1:512认为感染，计算病毒含量（ELD₅₀），结果如 下表10所示。

表10半成品病毒含量的测定（ELD₅₀/0.1ml）

2、冻干

向收获的细胞原液内加入相同体积的5%蔗糖脱脂乳（蔗糖5g+脱脂乳至 100ml），混匀、定量、冻干。

4、压盖、轧盖

冻干完成后，抽真空、压紧胶塞，并用铝盖轧紧密封，-20℃冻存。

按照以上方法分别制备了10批次疫苗。

5、成品检验

对冻存后的弱毒活疫苗进行效价测定，结果如下表11所示：

表11疫苗效力检验结果（单位：ELD₅₀/羽份）

二、血清HI抗体的测定

用1～2月龄雏鸡，滴鼻接种上述制备得到的疫苗0.5ml（含10^5.0ELD₅₀），接 种后21～28日，每只鸡采血，分离血清，进行HI抗体效价测定。结果如下表12 所示：

表12免疫鸡血清HI抗体的测定

三、免疫攻毒试验

用2～8月龄SPF鸡4只，各肌肉注射上述制备得到的疫苗1ml（含10^5.0ELD₅₀）， 10～14日后，与同条件饲养的未免疫对照鸡3只同时注射10^5.0ELD₅₀的鸡新城疫 北京株强毒1ml，观察10～14日，记录发病和死亡情况，结果如下表13所示：

表13疫苗免疫攻毒保护率的测定

表9至表13结果表明：利用H12株制备的活疫苗产品质量合格，滴度高、免 疫原性好、具备产业化生产的条件。

以上结果表明本发明分离得到的种毒随着在细胞筛选代次的增加，HA和 ELD₅₀逐渐稳定、安全性和免疫原性良好，技术指标均超过国家标准，具备了作为 疫苗株的所有条件。