G6PDH基因在提高黑根霉对甾体C11α-羟基化能力中的应用及菌株

（一）技术领域

本发明涉及G6PDH基因在提高黑根霉对甾体C11α-羟基化能力中的 应用，以及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因工程菌的构建方法，以及构建并筛 选获得的一株甾体C11α-羟基化较高的菌株——黑根霉（Rhizopus  nigericans）PIe。

（二）背景技术

氧化还原酶催化合成的产物被广泛应用于医药、食品、农药等领域， 酶催化过程中辅酶不足是限制大多数氧化还原酶进行生物催化合成产物 的主要因素。因此，辅酶循环再生对于酶催化过程显得非常重要，进而在 医药食品等相关的产品生产中体现重大的价值。文献报道辅酶的再生方法 包括酶法、光化学、电化学等再生方法，其中尤以酶法再生受到广泛重视。 常用于辅酶再生的酶有醇脱氢酶（ADH）、甲酸脱氢酶（FDH）、葡萄糖 脱氢酶（GDH）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）、亚磷酸脱氢酶（PTDH） 等，其中FDH和GDH的研究和应用较多，例如，Sheldon研究E.coli JM109 （pGDA2）过量表达来自于Bacillus megateriumIWG3葡萄糖脱氢酶基因， 当提供NADP+和葡萄糖时，E.coli JM109（pGDA2）能够作为NADPH的 再生系统。ZhinanXu将Bacillus megaterium AS1.223中的葡萄糖脱氢酶基 因gdh223通过克隆构建pQE30-gdh223表达载体，并在大肠杆菌中表达， 实现由4-氯乙酰乙酸乙酯到（R）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的转化。相对于 FDH和GDH，G6PDH用于辅酶再生的报道相对较少。

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PDH， EC1.1.1.49）是戊糖磷酸途径（PPP）氧化阶段中催化第一步反应的酶和 PPP代谢途径调控中的一个关键调控酶。G6PDH广泛存在于包括细菌、 植物、动物等各种生物细胞中，其催化的反应产生大量的还原型辅酶 NADPH，NADPH作为负氢离子供体提供还原力，满足许多细胞代谢过 程的需要，如脂肪酸固醇类的合成，光合作用中由CO₂合成葡萄糖，核 酸合成，维持红细胞中还原型谷胱甘肽水平等，因而G6PDH所催化的反 应在还原性生物合成中具有重要的作用。此外，G6PDH还与细胞生长发 育，溶血性贫血症、植物胁迫应答、心血管疾病，肿瘤等许多人类疾病有 关。

甾体化合物具有抗炎、抗真菌、免疫抑制、利尿、避孕等作用^[76]， 临床应用广泛，需求量大，已成为医药行业中仅次于抗生素的第二大类药 物，甾体羟基化中C₁₁α-羟基化是极其重要的甾体反应之一，通过C₁₁α- 羟基化引入高生理活性基团，可以显著提高甾体药物的疗效，减少副作用， 改变作用的专属性等。1952年Peterson和Murry等首次利用黑根霉一步 转化实现孕酮C₁₁α-羟基化生成C₁₁α-羟基孕酮，促进了可的松药物的的产 业化，随后，微生物转化甾体在甾体药物的生产中越来越受到重视。经过 近几十年的研究，黑根霉生物转化甾体C11α-羟基化工艺和技术已相对较 成熟，通过诱变育种改善了菌株转化能力，所以在现有菌株和工艺基础上 很难继续提高转化率，如何采用新的方法进一步改进菌株的生产能力就成 为该领域人员尤为关注的问题。

（三）发明内容

本发明目的是通过分子生物学方法将G6PDH克隆至黑根霉中，改造 菌种，拟在改造后的黑根霉细胞内实现G6PDH催化NADPH再生，向细 胞色素P450酶系催化的反应提供所需要的辅酶，改善黑根霉对甾体C11α- 羟基化的能力。

本发明采用的技术方案是：

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）基因在提高黑根霉对甾体C11α-羟 基化能力中的应用。

具体的，所述应用为：构建含有G6PDH基因的表达载体，将其导入 黑根霉中，筛选阳性克隆，获得对甾体C11α-羟基化能力提高的基因工程 菌。

具体的，所述G6PDH基因序列如SEQ ID No.1所示：

ATGTCGCATGAGGATTATATCCAACGTATCACTCAATATATCA AGGTGCAAGACCCTGAAAAGTTGGAAGCATTCAAACAGATGACAT CTTATGTCTCTGGTCAATATGATGAAGATGCCTCTTTCCAAAAGCT GAACGAGGCCATCGAAGCATCTGAAAAGGAAAGAAAGGCCGAAA AGAAAAATCGCGTGTATTATATGGCCCTGCCTCCTTCCGTCTTTATT CCCGTAGCACAAGGATTGAAACGCAATGTGTACACGCCAGAGGGA AGTAACAGGCTGGTGGTCGAGAAACCGTTCGGGATGGACTCTGAA TCCTCTGATCATTTAGGTCGTGAATTGGGTGCTCTCTTTACTGAAAA TGAGATTTATCGTATTGATCATTATCTCGGTAAAGAGATGGTGAAG AACATCATGAACCTTCGTTTTGCTAATGTCTTACTTGGACATGCCTG GAGTCGTACTTATGTTGATAACGTTCAGATCACGTTCAAGGAACCT TTTGGCACAGAAGGACGGGGTGGTTATTTTGATGAATTTGGCATCA TTCGTGATATCATTCAAAACCATTTACTTCAAGTCCTTTCCTTGATT GCTATGGAAAGACCTATCTCTACTGACTCTGAAGCCATTCGTGATG AAAAAGTCAAGGTGTTGAAGTGTATCTCTCCCATTCGTATCGAAGA TACCTTGTTGGGTCAATATGTTGCTGCTGATGGTAAGCCTGGCTAT CTTGAAGATGAAACGCTCAAGAACAAGGACAGTTTGACCCCTACTT TTGCTGCTACTGTTTGTTATGTGAATAATGAACGTTGGGAAGGCGT ACCCTTTATCTTGAAGGCAGGTAAGGCCTTGAATGAAGCCAAGGTC GAAGTTCGTCTGCAATTCCACCATGTGGCCGGTAATCTGTTTAGCG GGTCCCCTCGTAATGAGCTCGTCATTCGTATTCAACCCAAAGAGGC TGTGTATTTAAAATTCAACAACAAACAACCTGGTTTGTCCTACGAA ACCATTCAGACCGATCTCGACTTGACTTATCACGAACGTTATACTG ACCTTGCTATCCCTGACGCTTATGAATCTCTCATCTTGGATGTCTTG CGTAATGATCATTCAAACTTTGTAAGAGATGATGAACTTCAGGCTG CCTGGAAGATCTTTACACCTCTGCTTCACAAGATTGACAAGCATGA TTCCGATGTGGATATCAAGACATATGCTTATGGTTCTCGTGGTCCA AAGGAATTGGATGAATTCGTAAAGAAGCATGGTTATCACCGTGAT ACGAATGGTTACACTTGGCCTGTACAAAATGTAAATCCTTCTTCCA ACAAGCTTTAA。

本发明还涉及一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因工程菌的构建方法，所 述方法包括：

（1）从米根霉克隆得到其G6PDH基因，将其与质粒PMD19-TSimple 连接并转化，得到重组质粒PMD19-TSimple/G6PDH；

（2）重组质粒PMD19-TSimple/G6PDH经双酶切后，与质粒PCB1004 连接并转化，得到表达载体PCB1004-G6PDH；

（3）将表达载体PCB1004-G6PDH溶于溶液A中，使其浓度达到 1～5μg/μl，得到质粒溶液；溶液A组成如下：50mM CaCl₂，0.3 M甘露醇，溶剂为10mM MOPS（pH6.3）；

（4）每100μL黑根霉原生质体溶液加入10μL质粒溶液和10μL PEG 溶液，冰上放置30min后，再加入1.25ml PEG溶液，室温放置 30min，得到转化液；所述PEG溶液组成如下：50mM CaCl₂， 40～60%（w/w）PEG4000，溶剂为10mM MOPS（pH6.3）；

（5）转化液加入至MYG液体再生培养基，28℃静置培养5～10h后， 所得培养液涂布至MYG固体平板，28℃培养直至出现菌落， 转接到含有200～300μg/mL潮霉素B的MYG固体平板上，28℃ 培养，筛选具有潮霉素抗性的阳性克隆，提取转化子基因组， 进行PCR确定目的基因片段是否整合到黑根霉基因组中，鉴定 正确后保存。

所述MYG液体再生培养基组成如下：麦芽糖5g/L，酵母粉5g/L， 葡萄糖10g/L溶剂为水；所述MYG固体平板组成如下：麦芽糖5g/L， 酵母粉5g/L，葡萄糖10g/L，琼脂15g/L，溶剂为水。

具体的，上述步骤（1）中，所述G6PDH基因序列如SEQ ID No.1 所示。

本发明还涉及按照上述方法构建并筛选获得的一株甾体C11α-羟基 化较高的菌株——黑根霉（Rhizopus nigericans）PIe，该菌株保藏于中国 典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072，保 藏编号为：CCTCC No:M2013436，保藏日期为：2013年9月18日。

本发明的有益效果主要体现在：按照本发明方法构建的基因工程菌， 用于转化沃氏氧化物C₁₁α-羟基化生产霉菌氧化物，相比出发菌株，生长 快，原料利用率高，转化率和转化效率高，在甾体药物的开发和利用过程 中具有深远的理论意义和较高的应用价值。

（四）附图说明

图1为米根霉RNA琼脂糖凝胶电泳图谱；M：DL2000DNA Marker； Lane1：米根霉RNA；

图2为PCR扩增的G6PDH基因片段；M：DNA Marker；Lane1： G6PDH；

图3为TA克隆的转化子菌落PCR；M：DNA Marker；Lane1-5：5 个转化子菌落PCR；

图4为PMD19-TSimple-G6PDH质粒及酶切验证；M：DNA Marker； Lane1～5：5个转化子菌落PCR；

图5为测序结果比对；M：DNA Marker；Lane1：PMD19-T  Simple-G6PDH质粒；Lane2：BamHⅠ单酶切；Lane3：ApaⅠ单酶切； Lane4：BamHⅠ和ApaⅠ双酶切；

图6为PCB1004-G6PDH真菌整合表达载体构建过程；

图7为表达载体构建中转化子菌落PCR；M：DNA Marker；Lane1～5： 5个转化子菌落PCR；

图8为表达载体及其双酶切验证；M：DNA Marker；Lane1：PCB1004 质粒；Lane2：PCB1004-G6PDH质粒；Lane3：PCB1004质粒BamHⅠ 单酶切验证；Lane4：PCB1004质粒ApaⅠ单酶切验证；Lane5：PCB1004 质粒BamHⅠ和ApaⅠ双酶切验证；Lane6：PCB1004-G6PDH质粒 BamHⅠ单酶切验证；Lane7：PCB1004-G6PDH质粒ApaⅠ单酶切验证； Lane8：PCB1004-G6PDH质粒BamHⅠ和ApaⅠ双酶切验证；

图9为潮霉素抗性筛选的转化子；A：RG3转化子；B：RG12转化 子；

图10为出发菌株和转化子基因组DNA；M:λ-HindⅢdigest DNA  Marker；Lane1:出发菌株基因组DNA；Lane2:RG3转化子基因组DNA； Lane3:RG12转化子基因组DNA；

图11为PCR鉴定转化子；M:DNA Marker；Lane1:PCB1004-G6PDH质 粒（HPH）；Lane2:PCB1004-G6PDH质粒（G6PDH）；Lane3:3号转化子 基因组DNA（HPH）；Lane4:12号转化子基因组DNA（HPH）；Lane5:3 号转化子基因组DNA（G6PDH）；Lane6:12号转化子基因组DNA （G6PDH）；Lane7:纯化的HPH片段；Lane8:出发菌株基因组DNA（HPH）； Lane9:出发菌株基因组DNA（G6PDH）；

图12为底物和产物HPLC分析。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围 并不仅限于此：

实施例1：相关引物设计

根据已知的米根霉G6DPH基因序列（SEQ ID No.1）和E.coli潮霉 素抗性基因序列（SEQ ID No.2）设计引物F-g6pdh/R-g6pdh和引物F-hy  g/R-hyg（见表1），引物F-g6pdh/R-g6pdh两端分别添加BamHⅠ和Apa  Ⅰ酶切位点，引物F-hyg/R-hyg用于PCR鉴定黑根霉转化子。

表1：本发明涉及的引物

实施例2：米根霉总RNA的提取

将米根霉（CICC40467）菌丝体经液氮研磨后使用Takara公司的 RNAiso plus Total RNA提取试剂提取总RNA，并经过DNaseⅠ处理除去 基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳检测和吸光度分析，确保提取的RNA没 有降解和污染基因组DNA。

本发明提取的米根霉总RNA经吸光度分析：OD₂₆₀/OD₂₈₀=1.85，RNA 浓度为89μg/ml，琼脂糖凝胶电泳图如图1，根据琼脂糖凝胶电泳结果分 析提取的总RNA中28S和18S RNA条带清晰，未降解，说明RNA完 整性较好，另外提取的RNA中没有基因组DNA污染。

实施例3：米根霉G6PDH基因克隆

以提取的米根霉RNA为模板，以引物F-g6pdh/R-g6pdh（见表1）进 行RT-PCR扩增获得不含内含子的G6PDH基因片段，PCR产物琼脂糖凝 胶电泳检测结果如图2，从图上看出条带在1200～1400bp之间，这与数 据库中报道的G6PDH基因（包括内含子为1439bp，外显子1346bp）编 码序列大小符合。

将扩增得到的产物经过纯化回收后与PMD19-T Simple载体（购自 TaKaDa）连接后转化，从转化的平板上挑取5个单菌落进行菌落PCR， 结果如图3。由图可知，挑选的5转化子均为阳性。选择2号转化子扩大 培养，提取质粒并进行单双酶切验证，同时取1.0ml菌液送去测序。质 粒和酶切结果如图4，从图中可知，2号转化子含有G6PDH目的片段， 说明成功插入到了PMD19-TSimple载体，构建了PMD19-TSimple-G6PDH 克隆载体。将克隆载体测序，序列经过拼接后用DNAMAN软件比对2 号转化子基因序列与数据库中报道的序列相同（中间为两段内含子序列）， 没有突变，测序结果比对如图5，因此选择2号转化子保存G6PDH基因 片段。

实施例4：真菌整合表达载体PCB1004-G6PDH的构建

将重组PMD19-TSimple-G6PDH载体上的目的片段用限制性内切酶 BamHⅠ和ApaⅠ双酶切并纯化回收G6PDH目的片段，然后与BamHⅠ和 ApaⅠ双酶切后的真菌表达质粒PCB1004（由浙江工业大学朱廷恒博士惠 赠）连接，构建重组的PCB1004-G6PDH真菌表达载体，构建过程示意图 如图6。通过菌落PCR和双酶切验证筛选阳性转化子。菌落PCR和双酶 切验证结果分别如图7，图8，从图7中看出挑取的5个转化子中3号转 化子呈阳性，将其扩大培养提取质粒后双酶切验证，酶切验证结果表明3 号转化子提取的质粒中携带有G6PDH片段，为阳性转化子。另外，将其 进行测序后（SEQ ID No.1）结果比与报道的G6PDH序列一致，没有发 生突变。因此，我们成功构建出了PCB1004-G6PDH真菌表达载体。

实施例5：黑根霉对潮霉素敏感性试验

本发明采用接种菌块的方法，观察潮霉素对黑根霉（菌株由台州仙琚 药业提供，HG09-11-03）菌丝生长抑制，确定潮霉素抗性筛选的浓度。 不同浓度的潮霉素抗性MYG固体平板：采用混合浇注法分别制备0～300 μg/ml浓度梯度的潮霉素MYG固体平板。预先在不含潮霉素的MYG固 体平板上采用涂布孢子的方法获得生长旺盛的黑根霉菌丝，用灭菌枪头在 菌落生长边缘打孔，用接种针挑取打孔后的菌块接种于制备好的潮霉素抗 性平板正中央，每个梯度做3个平行试验。28℃避光培养36h，经过试 验，确定用于筛选的潮霉素抗性浓度为200～300μg/ml。

实施例6：黑根霉原生质体制备和PEG介导的原生质体转化及其筛选方 法

1、黑根霉原生质体的制备：

1）在PDA培养基平板上对黑根霉（台州仙琚药业，HG09-11-03）进行 菌种活化，培养温度28～30℃；PDA培养基终浓度组成为：马铃薯200g/L， 葡萄糖20g/L，琼脂粉15g/L，pH自然；

2）在PDA斜面上培养3～5天后，用无菌水洗下黑根霉孢子，玻璃珠打 散并用无菌纱布过滤制成孢子悬液后接种至MYG液体培养基，至于 28～30℃下静置培养14～16h；所述的MYG液体培养基终浓度为：麦芽糖 5g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖10g/L，溶剂为水；

3）收集步骤2）所得的菌丝，用无菌去离子水洗涤2次后，再用酶解液 （0.5mol/L MgSO₄，50mmol/L马来酸，溶剂为水，pH5.0）洗涤2次即 可；

4）lywallzyme（购自广东微生物研究所）和Yatalase（购自Takara）质量 比为5:7的混合酶溶解于无菌的0.5mol/L MgSO₄，50mmol/L DL-Maleate  aicd溶液中，制成终浓度为50mg/mL的细胞壁降解酶液；每1ml细胞壁 降解酶液加入约1.0g湿菌体，置30℃水浴锅，每20min轻轻摇匀，酶 解游离原生质体3～4h，得到原生质体酶解液；

5）将原生质体酶解液用1mol/L山梨醇溶液稀释，然后用双层无菌擦镜 纸过滤除去菌丝残片，5000r/min离心10min，得原生质体沉淀，并用1 mol/L山梨醇溶液悬浮调节原生质体浓度为10⁷～10⁸个/mL，得到原生质体 溶液；所述山梨醇溶液组成如下：1mol/L山梨醇，10mmol/L Tris-Cl，50 mmol/L CaCl₂，溶剂为水，pH7.0；

2、PEG介导的原生质体转化方法：

1.用溶液A（10mM MOPS（pH6.3），50mM CaCl₂，0.3M甘露醇） 溶解实施例4构建的表达载体PCB1004-G6PDH，使其浓度达到5μg/μL， 得到质粒溶液；

2.取10μL质粒溶液加入100μL制备的原生质体溶液中，冰上放置 30min，加入10μl PEG溶液（10mM MOPS（pH6.3），50mM CaCl₂， 50%PEG4000），冰上放置30min；

3.加入1.25ml PEG溶液（10mM MOPS（pH6.3），50mM CaCl₂， 50%PEG4000），室温放置30min，然后将转化液全部加入10ml YPG 液体再生培养基中，28℃静置培养5～10h，每个MYG固体平板上涂布 500μl静置培养了的培养液，28℃培养箱培养直至出现菌落。当菌落直 径生长至0.5～1.0cm时用无菌枪头打孔并转接到潮霉素抗性的平板上， 28℃培养，同时设置黑根霉出发菌株的阴性对照组。

4.观察每个转化子生长情况，将能在抗性平板上生长的转化子通过 打孔接种菌块法在潮霉素抗性平板上传代10代后观察其生长情况。

通过上述方法筛选到了2株具有潮霉素抗性的转化子RG3和RG12， 如图9所示。

实施例7:转化子基因组DNA提取及PCR鉴定

根据设计的引物F-g6pdh/R-g6pdh和引物F-hyg/R-hyg（表1），以提 取的转化子基因组DNA为模板进行PCR，同时提取出发菌株基因组DNA 作为对照组实验对实施例6中筛选到的RG3和RG12进行PCR鉴定。提 取的基因组DNA电泳图和PCR鉴定结果如图10、11。同时将PCR产物 测序确认与已知的序列完全一致，所以筛选的RG3和RG12转化子基因 组DNA上均整合了潮霉素B抗性基因和G6PDH基因片段，说明本发明 构建了两株黑根霉基因工程菌RG3和RG12，将活性较高的RG12命名为 PIe，进行了菌种保藏，其保藏编号为CCTCC No:M2013436。

实施例8：底物和产物HPLC分析检测条件及转化率计算

吸取0.5ml培养液，12000rpm/min离心2min，弃掉上清液，加入2 ml甲醇，震荡使菌丝充分悬浮，60℃浸泡3h，然后12000rpm/min离心 2～5min，取上清稀释后HPLC检测，色谱条件：色谱柱C₁₈柱，流动相： 乙腈：水（60:40，v/v），流速：1.0ml/min，进样量：5μl，检测波长λ： 240nm，柱温：室温。

本发明涉及的底物为沃氏氧化物，产物为霉菌氧化物，转化率按以下 公式计算：

底物和产物检测的HPLC图谱如图12所示，产物霉菌氧化物较早出 峰，底物较晚出峰。

实施例10：工程菌株的发酵试验

采用实施例7中鉴定的黑根霉基因工程菌RG3、R.nigericans PIe（即 RG12）和出发菌株，分别在发酵培养基（葡萄糖30g/L，玉米浆20g/L， 蚕蛹粉10g/L，硫酸铵1g/L，磷酸氢二钾5g/L，溶剂为水）中进行发 酵转化试验，发酵18h投入1.5%（W/V，即每100mL发酵液投入1.5g） 沃氏氧化物，继续转化48h。按实施例9检测转化率，实验结果为出发菌 株、RG3、R.nigericans PIe转化率分别为31.2±0.5%、36.1±0.5%和 53.2±0.5%。

因此，按照本发明方法构建的工程菌对提高沃氏氧化物羟基化的转化 率具有巨大的潜力，在甾体药物的开发和利用过程中具有深远的理论意义 和较高的应用价值。