一种水酶法-乙醇回流法提取茶叶籽多酚的方法

技术领域

本发明属于茶多酚的提取领域，具体涉及一种水酶法-乙醇回流法提取茶叶籽多酚的方法。

背景技术

中国是茶叶之乡，茶与茶叶籽资源极为丰富，但茶叶籽仅有少部分用于育种，大部分茶叶籽资源则长期处于白白浪费之中。长期以来人们对茶叶的研究远多于茶叶籽，且对茶叶籽的开发利用不足。国内外对茶叶籽的研究主要集中在茶叶籽油的提取精炼和茶皂素的提取上，而对茶叶籽多酚的研究开发较少，茶叶籽多酚具有抗菌、抗癌、抗病毒、抗衰老、降压降血脂等功效，在各个领域都有所应用，如农业、医药、日用化工和食品工业都得到广泛应用。因此，开发茶叶籽多酚，避免资源浪费有着十分重要的意义和广阔的前景。

目前水酶法提取茶叶籽中有效成分是一种较为绿色环保的方法，但是水酶法的提取率还不太高，一定程度上造成资源浪费，由于茶叶籽多酚的提取纯化工艺还不完善，因此寻找简单高效的提取方法提取茶叶籽多酚具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种水酶法-乙醇回流法提取茶叶籽多酚的方法，将水酶法和乙醇回流提取技术相结合，显著提高了茶叶籽中多酚的提取率。

本发明采用如下的技术方案：

一种水酶法-乙醇回流法提取茶叶籽多酚的方法，包括以下步骤：

（1）茶叶籽粉制备：茶叶籽去壳，粉碎过筛，烘干至恒重；

（2）称取茶叶籽粉，按照茶籽粉与反应液的料液重量/体积比为1:4-6先加入部分水，加热灭酶，然后冷却至室温，加入酶液及剩余水，搅拌均匀，调节温度60℃，搅拌酶解1.0-2.0h；

（3）乙醇回流提取：在酶解后的茶叶籽粉混合液中加入乙醇，使混合液中乙醇的体积百分比为40%-60%，料液比为1：20-30，在70-90℃条件下回流提取80-100min，冷却至室温后，在3500-4500r/min下离心5-15min，将离心后的上清液取出备用；滤渣用60%乙醇清洗数次，然后过滤，滤液与离心后的上清液合并，旋转蒸发、干燥即得目的产物。

优选地，所述步骤（2）中酶液为纤维素酶溶解于部分蒸馏水中制成，纤维素酶的用量为1-4mg/g茶叶籽粉；所述酶液配制时在低温条件下快速进行。

所述步骤（2）中茶籽粉与反应液的料液重量/体积比为1:5，酶解时间为1.5h。

所述步骤（3）混合液中乙醇的体积百分比为49%，料液比为1:24，提取温度为80℃。

更优选地，所述步骤（2）中纤维素酶的用量为2mg/g茶叶籽粉。

进一步地，一种水酶法-乙醇回流法提取茶叶籽多酚的方法，包括以下步骤：

（1）茶叶籽粉制备：茶叶籽去壳，粉碎过筛，烘干至恒重；

（2）水酶法提取：称取茶叶籽粉，按照茶籽粉与反应液的料液重量/体积比为1：5先加入部分水，100℃加热5分钟以消灭茶叶籽粉自身酶活性，然后冷却至室温，加入已配置好的酶液及剩余水，搅拌均匀，在60℃、搅拌条件下酶解1.5h；所述酶液为纤维素酶溶解于部分蒸馏水中在低温条件下快速制成，纤维素酶的用量为2mg/g茶叶籽粉；

（3）乙醇回流提取：在酶解后的茶叶籽粉混合液中加入乙醇，使混合液中乙醇的体积百分比为40%-60%，料液比为1：24，在80℃条件下回流提取90min，冷却至室温后，在3500r/min下离心10min，将离心后的上清液取出备用；滤渣用60%乙醇清洗2-3次，然后过滤，滤液与离心后的上清液合并，旋转蒸发、干燥即得目的产物。

本发明达到的有益效果：通过水酶法耦合乙醇回流提取技术，茶叶籽多酚的得率远高于按照国标法茶叶多酚总量测定方法得到的结果，说明采用该方法提取茶叶籽多酚具有明显优势。

以下通过下列实验来具体说明本发明的效果：

试验例1提取方法筛选

在茶叶籽多酚提取过程中，本发明人对提取工艺进行了设计和选择，以提取时间、茶叶籽多酚含量为考察指标，充分考虑水剂法、水酶法、水酶法-乙醇回流提取法三种方法对提取时间及多酚得率的影响，进行了一系列的选择试验。

样品A：按照国标GB/T8313-2008“茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法”中“试样制备”的方法制备；

样品B：按照本发明实施例1方法制备；

样品C：按照本发明实施例1方法，去除步骤3）制备，即仅采用水酶法提取，其中酶解时间为1.5h；

上述方法中茶叶籽粉原料均为2g，得到的目的产物的考察结果见表1。

表1工艺选择实验结果

上表可以看出，采用本发明所述的水酶法耦合乙醇回流技术提取茶叶籽多酚，茶叶籽多酚含量大大高于样品A，即本发明方法显著优于现有国标法中样品试制的简单提取方法，且总耗时与其他方法相比差别不大；另外单独采用水酶法提取茶叶籽多酚，含量明显低于本发明。说明本发明在水酶法的基础上由于耦合了乙醇回流提取技术，提高了多酚含量，是理想的提取方法。

下面对提取各工艺参数作进一步的研究。

试验2：水酶法提取各参数对提取率的影响

2.1酶添加量对多酚提取量的影响

准确称取5份干燥至恒重的茶叶籽粉，各2g，分别加入烧杯中。加入不同质量的纤维素酶，使酶用量分别为1mg/g、2mg/g、3mg/g、4mg/g、5mg/g,保持料液比为1:5，酶解1.5h，酶解温度60℃的条件下酶解，然后加入60%乙醇使液料比为1:25，在80℃水浴锅中回流提取半小时，降至常温后离心，残渣用60%乙醇清洗2-3次，过滤后与上清液合并，定容至100ml。取一定体积溶液进行多酚含量测定。结果见表2。

表2酶添加量对多酚得率的影响

从上表可知，在一定范围内，茶叶籽总多酚得率随着酶量的增加而逐渐增加，当酶用量达到2mg/g，即得率达到最大值，之后继续加大酶添加量，茶叶籽多酚得率反而下降。故选择加酶量范围为1-3mg/g，优选为2mg/g。

2.2酶解时间对总多酚提取量的影响

准确称取5份干燥至恒重的茶叶籽粉，各2g，分别加入烧杯中。保持酶添加量为2mg/g，料液比为1:5，酶解温度为60℃，分别酶解0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h。然后加入60%乙醇使液料比为1:25，在80℃水浴锅中回流提取半小时，降至常温后离心，残渣用60%乙醇清洗2-3次，过滤后与上清液合并，定容至100ml。取一定体积溶液进行多酚含量测定。结果见表3。

表3酶解时间对多酚提取率的影响

从上表可知，在其他条件一定时，在0.5-1.5h内随着酶解时间的增加多酚提取率升高，当酶解时间为1.5h时多酚提取率最高，随酶解时间的增加，茶叶籽粉总多酚得率反而下降，故选择时间范围为1-2小时，优选1小时。

2.3料液比对总多酚提取量的影响

准确称取5份干燥至恒重的茶叶籽粉，各2g，分别加入烧杯中。保持酶解温度为60℃，酶解半小时，酶添加量为2mg/g，使料液比（g：ml）分别为1:3、1:4、1:5、1:6、1:7。然后加入60%乙醇使液料比为1:25，在80℃水浴锅中回流提取半小时，降至常温后离心，残渣用60%乙醇清洗2-3次，过滤后与上清液合并，定容至100ml。取一定体积溶液进行多酚含量测定。结果见表4。

表4液料比对茶叶籽多酚提取率的影响

从上表可知，在料液比为1:3到1:5期间，随着料液比的增加茶叶籽多酚提取率也随之增加，之后，随着料液比的增加，茶叶籽总多酚得率反而下降。故选择料液比为1：4-6，优选料液比为1:5。

2.4酶解反应条件

上述实验结果得出，在酶解反应中选择加酶量为1-3mg/g，料液比为1:4-6，反应时间为1-2h，茶叶籽的总多酚含量理想.最优条件为：加酶量2mg/g，料液比1:5，反应时间为1.5h。

试验3：乙醇回流提取法对多酚提取率的影响

3.1提取温度对茶叶籽多酚得率的影响

茶叶籽多酚是一类极易被氧化的化合物，主要是茶叶籽中的多酚氧化酶的酶促氧化，而在实验中，有5min的高温灭酶，在浸提过程中，茶叶籽多酚的氧化基本排除了酶促氧化的作用。茶叶籽多酚的非酶促氧化主要受温度、时间等因素的影响，温度过高会使茶叶籽多酚氧化，但在低温条件在提取又需要延长提取时间，而过长的提取时间也会导致茶叶籽多酚氧化，故而，既要考虑到时间不宜过长，也不可在过高温度下提取。本实验采用了不同温度进行提取实验，方法如下：

准确称取5份干燥至恒重的茶叶籽粉，各2g，经酶解后，按照液料比为1:20，乙醇体积分数60%，提取时间为90min，回流温度分别为50℃、60℃、70℃、80℃、90℃回流提取后，冷却至室温，转入离心机在3500转/分的转速离心10min，将上清液转移至100ml容量瓶，残渣用60%乙醇清洗，将滤液再转移到100ml容量瓶，用60%乙醇定容至100ml，摇匀，过0.45μm膜。取一定体积溶液进行多酚含量测定。结果见表5。

表5提取温度对茶叶籽多酚得率的影响

由上表可知，在乙醇回流提取过程中，茶叶籽多酚的得率随温度的升高而增大,当提取温度达到80℃时,茶叶籽多酚得率为8.83mg/g,随着提取温度进一步升高,茶叶籽多酚的得率又有所降低,是因为在温度较高时,茶叶籽多酚的氧化程度加强。因此,选择提取温度为70-90℃最为理想，其中当提取温度为80℃时，茶叶籽多酚得率最高。

3.2乙醇浓度对茶叶籽多酚得率的影响

目前，用于茶叶籽多酚提取的溶剂一般有甲醇、水、乙醇、丙酮、等，由于茶叶籽多酚大多应用于食品工业，使用的溶剂不能有致癌及毒副作用。本实验采用了不同浓度的乙醇水溶液进行提取实验，方法如下：

准确称取5份干燥至恒重的茶叶籽粉，各2g，经酶解后，按照液料比为1:20，提取时间为90min，回流温度为70℃，乙醇体积分数40%、50%、60%、70%、80%，回流提取后，冷却至室温，转入离心机在3500转/分的转速离心10min，将上清液转移至100ml容量瓶，残渣分别用不同浓度乙醇清洗，将滤液再转移到100ml容量瓶，分别用不同浓度乙醇定容至100ml，摇匀，过0.45μm膜。取一定体积溶液进行多酚含量测定。结果见表6。

表6乙醇浓度对茶叶籽多酚得率的影响

上表可知，在乙醇回流提取过程中，乙醇浓度在40%-50%的范围内，随着乙醇浓度的增大茶叶籽多酚的得率增加，提取液颜色加深。当乙醇浓度达到50%时，茶叶籽多酚得率为8.67mg/g。随着乙醇浓度继续增大，茶叶籽多酚得率有所下降。因此，选择乙醇浓度范围为40-60%，其中浓度为50%时，茶叶籽多酚得率最高。

3.3料液比对茶叶籽多酚得率的影响

准确称取5份干燥至恒重的茶叶籽粉，各2g，经酶解后，按照1:10、1:15、1:20、1:25、1:30的液料比，提取时间为90min，回流温度为70℃，乙醇体积分数60%，回流提取后，冷却至室温，转入离心机在3500转/分的转速离心10min，将上清液转移至100ml容量瓶，残渣用60%乙醇清洗，将滤液再转移到100ml容量瓶，用60%乙醇定容至100ml，摇匀，过0.45μm膜。取一定体积溶液进行多酚含量测定。结果见表7。

表7料液比对茶叶籽多酚得率的影响

上表可知，在乙醇浓度为60%，提取温度为70℃的条件下，随料液比的增大茶叶籽多酚得率呈上升趋势，当料液比为1∶25时，茶叶籽多酚得率为8.42mg/g，但当料液比超过1∶25后，茶叶籽多酚得率有所下降。因此，选择料液比范围为1:20-30最为理想，其中1∶25时，茶叶籽多酚得率最高。

试验4：验证试验

采用上述优化出的最佳工艺参数，对茶叶籽粉提取三次，其验证实验结果如表6所示。

表6验证实验结果

具体实施方式：

实施例1

水酶法-乙醇回流法提取茶叶籽多酚的方法，包括以下步骤：

（1）茶叶籽粉制备：茶叶籽去壳，粉碎过筛，烘干至恒重；

（2）水酶法提取：称取茶叶籽粉10g，按照茶籽粉与反应液的料液重量/体积比为1：5先加入30ml水，100℃加热5分钟以消灭茶叶籽粉自身酶活性，然后冷却至室温，加入已配置好的酶液及剩余水，搅拌均匀，在60℃、搅拌条件下酶解1.5h；所述酶液为纤维素酶溶解于部分蒸馏水中在低温条件下快速制成，纤维素酶的用量为2mg/g茶叶籽粉；

（3）乙醇回流提取：在酶解后的茶叶籽粉混合液中加入乙醇，使混合液中乙醇的体积百分比为49%，料液比为1：24，在80℃条件下回流提取90min，冷却至室温后在3500r/min下离心10min，将离心后的上清液取出备用；滤渣用60%乙醇清洗2-3次，然后过滤，滤液与离心后的上清液合并，旋转蒸发、干燥即得目的产物。经检测，多酚含量为9.52mg/g。

实施例2

水酶法-乙醇回流法提取茶叶籽多酚的方法，包括以下步骤：

（1）茶叶籽粉制备：茶叶籽去壳，粉碎过筛，烘干至恒重；

（2）水酶法提取：称取茶叶籽粉10g，按照茶籽粉与反应液的料液重量/体积比为1：4先加入20ml水，100℃加热5分钟以消灭茶叶籽粉自身酶活性，然后冷却至室温，加入已配置好的酶液及剩余水，搅拌均匀，在60℃、搅拌条件下酶解1h；所述酶液为纤维素酶溶解于部分蒸馏水中在低温条件下快速制成，纤维素酶的用量为1mg/g茶叶籽粉；

（3）乙醇回流提取：在酶解后的茶叶籽粉混合液中加入乙醇，使混合液中乙醇的体积百分比为40%，料液比为1：20，在80℃条件下回流提取80min，冷却至室温后，在4000r/min下离心5min，将离心后的上清液取出备用；滤渣用60%乙醇清洗2-3次，然后过滤，滤液与离心后的上清液合并，旋转蒸发、干燥即得目的产物。经检测，多酚含量为8.91mg/g。

实施例3

水酶法-乙醇回流法提取茶叶籽多酚的方法，包括以下步骤：

（1）茶叶籽粉制备：茶叶籽去壳，粉碎过筛，烘干至恒重；

（2）水酶法提取：称取茶叶籽粉10g，按照茶籽粉与反应液的料液重量/体积比为1：6先加入40ml水，100℃加热5分钟以消灭茶叶籽粉自身酶活性，然后冷却至室温，加入已配置好的酶液及剩余水，搅拌均匀，在60℃、搅拌条件下酶解2h；所述酶液为纤维素酶溶解于部分蒸馏水中在低温条件下快速制成，纤维素酶的用量为3mg/g茶叶籽粉；

（3）乙醇回流提取：在酶解后的茶叶籽粉混合液中加入乙醇，使混合液中乙醇的体积百分比为40%，料液比为1：30，在80℃条件下回流提取100min，冷却至室温后在3000r/min下离心15min，将离心后的上清液取出备用；滤渣用60%乙醇清洗2-3次，然后过滤，滤液与离心后的上清液合并，旋转蒸发、干燥即得目的产物。经检测，多酚含量为9.44mg/g。

实施例4

水酶法-乙醇回流法提取茶叶籽多酚的方法，包括以下步骤：

（1）茶叶籽粉制备：茶叶籽去壳，粉碎过筛，烘干至恒重；

（2）水酶法提取：称取茶叶籽粉10g，按照茶籽粉与反应液的料液重量/体积比为1：5先加入30ml水，100℃加热5分钟以消灭茶叶籽粉自身酶活性，然后冷却至室温，加入已配置好的酶液及剩余水，搅拌均匀，在60℃、搅拌条件下酶解1.5h；所述酶液为纤维素酶溶解于部分蒸馏水中在低温条件下快速制成，纤维素酶的用量为2mg/g茶叶籽粉；

（3）乙醇回流提取：在酶解后的茶叶籽粉混合液中加入乙醇，使混合液中乙醇的体积百分比为50%，料液比为1：25，在80℃条件下回流提取90min，冷却至室温后，在3500r/min下离心8min，将离心后的上清液取出备用；滤渣用60%乙醇清洗2-3次，然后过滤，滤液与离心后的上清液合并，旋转蒸发、干燥即得目的产物。经检测，多酚含量为9.41mg/g。