一种实时监测动物脑组织胞外间隙动态变化的方法

技术领域

本发明属于神经生理医学技术领域，涉及一种神经信号的获得及处理方法，具体是 一种实时监测动物脑组织胞外间隙动态变化的方法。

背景技术

了解脑组织细胞生存的胞外空间微环境对于了解脑细胞的活性及各种疾病的发生前 兆有重不可或缺的重要关系。分子在细胞间的扩散受2个物理因素制约，第一是狭小的细 胞外间隙(或称胞外空间)使得分子浓度相对增加，其胞外空间占组织总体积的分率定义为 α；第二是胞外间隙的曲折度λ，弯曲的胞外间隙路径使胞外间隙的扩散缓慢。脑胞外间隙 的大小及构造细节并非固定而是随细胞新陈代谢活性、离子浓度、或各种应激而作相应的 调整，而参数α和λ决定了分子在胞外间隙扩散的快慢和信息传递的有效距离，是决定脑 胞外结构的重要参数。

对脑胞外间隙的常用测定方法是监测一些不易被细胞膜吸附或吸收的分子探针的胞 外浓度。传统的阶跃式实时离子电泳实验方法(Nicholson&Phillips,1981,J Physiol(Lond) vol.321,pp.225-257)是以阶跃形式电泳方法导入胞外离子探针至组织胞外间隙，并以离子 选择性电极在导入点固定距离外实时测量胞外离子探针浓度的扩散变化，经由电脑拟合时 间域的扩散曲线以得到α和λ。由于此方法的实施是在假设胞外结构恒定的前提下，因此无 法正确地监测急性病理态下的脑胞外间隙动态变化并提供足够的时间分辨率。另一种实验 常用的方法是以离子探针的浓度倒数变化来表示胞外空间改变的百分比，但是此种方法误 差极大且在脑片灌流情况下易受灌流液的影响。截至目前为止，尚无任何可行的方法来研 究脑胞外组织的动态结构。

发明内容

针对现有技术存在的不足,本发明提供了一种实时监测动物脑组织胞外间隙动态变 化的方法，通过频率域数据的分析得到脑组织的动态间隙结构，由模拟验证本发明方法能 方便可靠地量测急性病理态下的脑组织胞外结构变化，可填补此领域空白。

为了实现上述的目的，一种实时监测动物脑组织胞外间隙动态变化的方法，简称相 位偏移法，采用如下的技术方案：

该方法是通过分析胞外示踪探针在固定频率下所产生的正弦扩散波形中的相位偏移及波形 振幅来实现实时监测脑组织的动态间隙结构，这种方法可简便快速地得到急性病理态下活 体动物或离体脑组织的动态结构变化。

其中，所述胞外示踪探针的电泳电流包括两个成分：恒定的电泳电流I₀和正弦电泳 电流I₁，所述的正弦电泳电流I₁具有固定频率，随时间作正弦变化并且无限循环，另外恒 定的电泳电流I₀必须大于正弦电泳电流I₁。两者的组合关系为公式[1]：

I(t)＝I₀+I₁sin(ωt–ε)，           [1]

其中，I₀为恒定电流，I₁为正弦循环电流，sin为正弦函数，t为时间(秒)，ω为周期频率， ε为起始相差。

实时监测动物脑组织胞外间隙动态变化的方法具体包含以下步骤：

S1：将胞外示踪离子探针以固定频率的正弦电泳电流和恒定电流组合方式导入于活体或离 体的动物脑组织中；

S2：以离子选择性侦测电极实时记录病理态下的示踪探针组织的胞外扩散浓度；

S3：每次自所记录的探针浓度曲线取一个完整周期波形，以周期平均法去除振荡成分以获 得平滑的探针胞外浓度曲线，周期平均法代替传统低通滤波器以消除特定频率成分；

S4：将原记录的探针浓度正弦波形与所述的的平滑的探针胞外浓度曲线相减，得到无基线 偏移的振幅波形；

S5：取一段固定长度的无基线偏差的波形数据，以Levernberg-Marquardt运算法作最适拟合， 得到平均时间点的最适振幅A与相位差θ，向右移动一个时间点并重复所述的 Levernberg-Marquardt法作最适拟合，直至到达波形尾端，以获得完整的波形振幅A(t)及相位 θ(t)变化的时间函数；

S6：运用数学公式[2]和[3]，分析波形振幅及相位变化，将在某一个时间点t_i的探针浓度 正弦波形振幅A_i与相位差θ_i代入下列关系式以求得最适合的α_i和λ_i:

$A=\frac{n_t{I}_1{\lambda }^2}{4\mathrm{\pi rzF\alpha D}}\exp [-\mathrm{r\lambda }\sqrt{\frac{\sqrt{{\omega }^2+{\kappa }^2}+\kappa }{2D}}]---\left[2\right]$

${\left(\frac{\theta }{r}\right)}^2=\frac{{\lambda }^2}{2D}[\sqrt{{\omega }^2+{\kappa }^2}-\kappa ]---\left[3\right]$

其中，F为法拉第常数，z为离子探针电荷常数，r为探针扩散距离，κ为离子探针线性清除 速率常数，D为离子探针在水溶液中无阻碍扩散系数，n_t为离子探针电泳分率，除了参数α 和λ为自变数(振幅A_i与相位差θ_i为因变数)外，其它皆为已知不变的参数；

S7：重复上述步骤S5-S6以求得下一个时间点t_i+1的α_i+1和λ_i+1数值。

其中，我们说明步骤S2中由于电泳导入的离子探针需花一定时间扩散到离子探针选 择性电极所在位置(约100微米远)，选择性侦测电极所记录的胞外离子探针浓度在到达动态 稳定后会呈现与电泳释放端相同的振荡频率，但是二者之间存在一固定的相位差θ(参见附 图1)，此相位差是扩散参数的函数。以离子探针选择性侦测电极记录一段数据后，自所记 录的探针浓度曲线取一个完整周期波形，以周期平均法求得其在周期的中间时间点的离子 平均浓度，依此每次向右移动一个时间点并重复周期平均法，直至得到一条没有正弦震荡 的平滑基线；步骤S3中获取平滑基线的方法也可以传统低通滤波器得到类似的结果，但是 低通滤波器容易产生程度不等的时间延迟并常有“振铃”现象发生，本发明的特点之一是 使用了周期平均法以消除特定频率成分，可保证更好的数据品质。

电脑模拟测试证实本发明方法即使在α与λ作阶跃式变化的严峻条件下仍然可准确 获得原模拟假设的α与λ的时间曲线。

本方法的有益效果是，可以实时监测急性病理态(如脑缺血、癫痫、传播性抑制、失 血性休克等)发生时脑组织胞外结构的动态变化，对了解脑细胞的生理应激反应和增进脑科 医学知识有莫大帮助。

附图说明

图1是相位偏移法离子电泳与离子探针电极的实验装置示意图。

图2是滑动周期平均法的实施示意图。

图3是以电脑数值模拟传播性抑制发生时的离子探针扩散的实施示意图。

图4是相位偏移法分析数据的流程图。

图5是以相位偏移法分析电脑模拟活体动物脑组织在传播性抑制发生时脑胞外结构的变化 结果，探针释放频率为ω＝0.08Hz。

图6是以相位偏移法分析电脑模拟离体脑片在传播性抑制发生时脑胞外结构变化的结果， 探针释放频率为ω＝0.08Hz。

图7是以相位偏移法分析麻醉大鼠在体脑组织在传播性抑制(一种常见的病理态)发生时脑

胞外结构的变化结果。

图8是以相位偏移法分析大鼠离体脑片在传播性抑制发生时脑胞外结构的变化结果。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步的描述：

如图1所示，1为离子探针选择性侦测电极，2为离子探针电泳释放电极，3为差分放大器， 4为参考电极，5为相位差θ，其中离子探针选择性侦测电极1与离子探针电泳释放电极2 相差一个固定的相位差θ：如图2所示，6为周期平均法的平均窗口。

实施例1

以电脑模型来验证相位偏移法的可行性和准确性。

1.如图3所示，电脑模拟中构建的α(z,t)和λ(z,t)不仅是时间的函数且是一维空间z的函数。

2.如图3所示，α(z,t)和λ(z,t)的变化模拟一种病理态：传播性抑制(Spreading Depression, 一种常见的病理态)，并假设传播性抑制为一维传播，传播速度u为2.5mm/min，传播的 时间空间函数图形以如图3标号7的Ψ(ξ)来表示，所模拟的Ψ(ξ)函数包括了代表胞外结 构剧烈变化的方波及柔和变化的正弦波。

3.模型中不同边界条件的设定可模拟在体组织(无扩散边界)或脑片(具扩散边界，需定义边 界离子探针浓度)中的胞外间隙扩散实验。

4.构建新模型后以电脑模拟α(z,t)和λ(z,t)在不同空间及时间尺度变化下所得到的离子探针 (假设是四甲基铵离子)扩散波形，再以相位偏移法捕捉四甲基铵扩散波形中的α和λ变 化。

5.与模型的α(z,t)和λ(z,t)相比较，分析其中差异。

6.数值模拟结果如附图5，图6所示，其中图5模拟在体组织结果，图6模拟离体脑片结果；标 号8是滑动周期平均法的平均曲线，9是恒定电泳电流单独所得的离子探针浓度曲线，10 是相减所得的无基线偏差的浓度波形，11是电脑模拟的理论曲线，12是由相位偏移法分析 所得的曲线，13是由平滑基线倒数所得的α变化；附图5和6还分别绘出了活体动物和离体 脑片中以相位偏移法计算的λ和α与电脑模拟的α(z,t)和λ(z,t)差异分布；分析结果显示以相 位偏移法计算得出的λ和α虽与理论值有少许误差，但是整体的变化趋势仍与模拟的α和λ 函数相符合；但是以离子探针平滑基线的倒数所得的α(即以标号13标示的虚线)则无法准 确反应模型中α的真实变化，多数情形下过大估计了α的缩减,如附图5和6的标号13所示。

7.附图5和图6表明，只有在真实的α和λ做快速改变时才会导致相位偏移法产生剧烈震荡的 分析结果；如果真实的α和λ缓慢柔和变化，相位偏移分析方法可完全重现α和λ的模拟结 果。

这些结果证明了本方法的优越性并支持了本方法在短暂急性病理态过程中能准确地 报告脑组织胞外结构变化情形的推论。

下面两个实施例首次报告将经过电脑模拟验证后的相位偏移法应用在活体及离体实 验动物脑组织上。

实施例2

在活体麻醉大鼠脑皮层中实时监测传播性抑制发生时的脑胞外结构变化。

1.Sprague-Dawley成年大白鼠(重量为200-300克)经水合氯醛腹腔麻醉后，固定头部于立体定 位器并以颅骨钻在躯体运动皮质区上方开出一直径5厘米窗口。

2.以微操作仪分别插入钾离子选择电极，离子探针(四甲基铵离子)释放电极-离子探针侦测 电极阵列，及参比电极于皮层下1厘米处。

3.选定一个特定频率ω(频率范围为0.04～0.25Hz)与相差ε,根据公式(1)启动离子电泳仪并 开始同步离子探针胞外浓度和场电位记录。待场电位、钾离子及离子探针记录稳定后诱发 传播性抑制或急性癫痫病理态。

4.传播性抑制以高浓度氯化钾(0.5M)气压式局部注射至组织内诱发，传播性抑制的发生由胞 外场电位记录观察有无阵发性去极化偏移、由场电位的马鞍形去极化波形、和胞外钾离子 浓度的同步变化来确认。

5.以氯化钾诱发急性病理态并全程执行相位偏移法记录，储存记录与电脑硬盘后根据图4中 所描述步骤分析数据，得到α(t)与λ(t)的时间变化，具体步骤如下：

5.1每次自所记录的探针浓度曲线取一段完整周期波形，以周期平均法求得其在周期的 中间时间点的离子平均浓度，依此每次向右移动一个时间点并重复周期平均法，直至得到 一条没有正弦震荡的平滑基线；

5.2将所记录的探针浓度正弦波形与运用滑动周期平均法后的平滑基线相减，得到一无 基线偏差的振幅波形；

5.3取一段固定长度的无基线偏差的波形数据，以Levernberg-Marquardt运算法作最适 拟合，得到平均时间点的最适振幅A与相位差θ；

5.4向右移动一个时间点并重复前述的Levernberg-Marquardt法作最适拟合，直至到达波 形尾端，此时获得完整的波形振幅A(t)及相位θ(t)变化的时间函数；

5.5将在某一个时间点t_i的探针浓度正弦波形振幅A_i与相位差θ_i作最适拟合，得到此时 间段最适合的α_i和λ_i数值:

5.6重复上述步骤5.4-5.5以求得下一个时间点t_i+1的α_i+1和λ_i+1值。

6.图7为活体实验结果，如图7所示，14是胞外场电位的变化，15是探针电极所得的离子探针 浓度曲线，16是原浓度波形与由平滑基线相减后所得的无基线偏差的浓度波形，圆点(17) 是相位偏移法分析所得的α变化，虚线18是由平滑基线倒数所得的α变化，圆点19是由相 位偏移法分析所得的λ变化；实验发现平均而言，传播性抑制发生时α可下降至基线的40％， 而λ增加了～22％；由图7可看出自平滑基线倒数所得的α变化(18标示的虚线)与由相位偏移 分析所得的α变化有所差异，而由之前的电脑模拟结果我们知道自平滑基线倒数所得的α 大多高估了胞外空间容积分率在病理态发生时的缩减；另外由之前的电脑模拟结果我们得 知只有在真实α和λ做快速改变时会导致相位偏移法产生剧烈震荡的分析结果，因此相位 偏移法在传播性抑制发生的初期所得到的α和λ震荡可推测为脑组织胞外空间在传播性抑 制发生时产生了类似冲击波(shockwave)所导致的结果。

实施例3

在大鼠离体脑片实时监测传播性抑制发生时的脑胞外结构变化。

1.Sprague-Dawley成年大白鼠经水合氯醛(400mg/kg)腹腔麻醉后，断头取脑，并在冰冻温度 下将脑组织切成400微米厚度的脑片。

2.将切好的脑片置放于全浸式脑片记录槽，以通氧并含有0.5mM四甲基铵的人工脑脊液灌流， 室温下复育脑片1小时。

3.以微操作仪分别将钾离子选择电极，离子探针(四甲基铵离子)释放电极-离子探针侦测电 极阵列，及参比电极插入于新皮层位置，约距脑片表层下方200微米处，距离脑片边缘至少1 厘米远。

4.执行相位偏移法记录及诱发病理态。除了原本插入脑片组织表面下方200微米处的四甲基 铵离子探针选择性电极，另放置一四甲基铵选择性电极于脑片边界与人工脑脊液交界处，并 在传播性抑制发生时暂时停止灌流人工脑脊液流动以监测脑细胞肿胀时与灌流液之间有无四 甲基铵离子交换。

5.在人工脑脊液中加入浓度为0.1M的氯化钾诱发传播性抑制，由场电位记录有无阵发性去极 化偏移、由场电位的马鞍形去极化波形、和胞外钾离子浓度的同步变化来确认诱发是否成功；

6.诱发急性病理态全程执行相位偏移法记录，储存记录与电脑硬盘后根据图4中所描述步骤 分析数据，得到α(t)与λ(t)的时间变化，具体步骤如下：

6.1每次自所记录的探针浓度曲线取一段完整周期波形，以周期平均法求得其在周期 的中间时间点的离子平均浓度，依此每次向右移动一个时间点并重复周期平均法，直至得 到一条没有正弦震荡的平滑基线；

6.2将所记录的探针浓度正弦波形与运用滑动周期平均法后的平滑基线相减，得到一 无基线偏差的振幅波形；

6.3取一段固定长度的无基线偏差的波形数据，以Levernberg-Marquardt运算法作最 适拟合，得到平均时间点的最适振幅A与相位差θ；

6.4向右移动一个时间点并重复前述的Levernberg-Marquardt法作最适拟合，直至到达波 形尾端，此时获得完整的波形振幅A(t)及相位θ(t)变化的时间函数；

6.5将在某一个时间点t_i的探针浓度正弦波形振幅A_i与相位差θ_i作最适拟合，得到此时 间段最适合的α_i和λ_i；

6.6重覆上述步骤6.4-6.5以求得下一个时间点t_i+1的α_i+1和λ_i+1值。

7.另在灌流脑脊液无四甲基铵的情况下(可最大限度限制四甲基铵自脑脊液回流至脑片)重 复实验，以四甲基铵离子选择性电极和相位偏移法记录和分析胞外间隙扩散信号，分析由公 式(2)和(3)所得到的α(t)与λ(t)的时间变化。

8.图8为离体脑片实验结果，如图8所示，14是胞外场电位的变化，15是探针电极所得的离子 探针浓度曲线，16是原浓度波形与由平滑基线相减后所得的无基线偏差的浓度波形，圆点17 是相位偏移法分析所得的α变化，虚线18是由平滑基线倒数所得的α变化,圆点19是由相位偏 移法分析所得的λ变化。由图可看出自平滑基线倒数所得的α变化(18标示的虚线)与由相位偏 移分析所得的α变化有所差异，而由之前的电脑模拟结果我们知道自平滑基线倒数所得的α大 多高估了胞外空间容积分率在病理态发生时的缩减；和活体实验类似，离体脑片的胞外空间 在传播性抑制发生时也产生了类似冲击波(shockwave)的变化，但整体来说程度较小，另外λ 的变化(～10％的增强)也较活体实验小。