一种提高轮枝链霉菌产转谷氨酰胺酶活力的方法

技术领域

一种提高轮枝链霉菌产转谷氨酰胺酶活力的方法，属于酶工程技术领域。

背景技术

转谷氨酰胺酶，又称谷氨酰胺转胺酶(Transglutaminase，EC2.3.2.13，简称TGase)，是一种催化酰基转移反应的转移酶。它能催化酪蛋白、乳球蛋白、肌球蛋白、面筋蛋白等蛋白质发生分子内和分子间的交联反应，从而改变蛋白质的功能性质，因此在食品工业中有良好的应用前景，但动物和植物组织来源的转谷氨酰胺酶成本较高，阻碍了它在食品工业中的进一步推广。

1989年日本味之素公司和天野制药公司合作从5000多株放线菌中筛选出产转谷氨酰胺酶活力较高的轮枝链霉菌(Streptoverticillium)，开创了微生物转谷氨酰胺酶的发酵法生产。随后许多学者致力于微生物转谷氨酰胺酶的发酵生产研究：1996年Zhu等运用黑箱模型设计优化了轮枝链霉菌的产酶培养基；1997年Junqua等运用试验设计方法优化了培养基；1996年吴介文提出添加蛋氨酸或甘氨酸有利于转谷氨酰胺酶的产生；1998年Zhu等运用质量平衡理论分析了轮枝链霉菌发酵过程中氨基酸的代谢情况，提出流加硫酸铵促进产酶的方法；2001年常中义等提出人造沸石可解除铵离子的阻遏作用，从而提高产酶；2002年郑美英等研究了pH控制在微生物转谷氨酰胺酶发酵生产中的应用。

在对轮枝链霉菌SK4.001(江南大学食品科学研究室保存)产转谷氨酰胺酶的研究中，发现存在产酶不稳定的问题。在分别研究了菌种(包括菌种的传接代数、保存方式、接种量等)、氮源、水质等对SK4.001发酵生产转谷氨酰胺酶稳定性的影响后发现：培养基中金属离子的含量是影响产酶稳定性的主要因素。研究金属离子在转谷氨酰胺酶生产中的作用在国内外尚属首次，本发明重点研究了Zn²⁺对菌株SK4.001生长及产转谷氨酰胺酶的影响，并运用螯合剂EDTA对酶液进行透析的方法初步研究了Zn²⁺的作用机理。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高轮枝链霉菌产转谷氨酰胺酶活力的方法，首次提出：在液体培养基中添加一定浓度Zn²⁺离子，可提高菌体生长量和提高酶活力。

本发明的技术方案：以轮枝链霉菌(Streptoverticillium)为生产菌种，如以轮枝链霉菌SK4.001为生产菌种，在液体培养基中添加Zn²⁺离子，添加量为3ug/mL-50ug/mL。

当培养基中Zn²⁺添加量由Oug/mL增加到3ug/mL，菌体生长量由10.23mg/mL增为16.99mg/mL。Zn²⁺含量继续增加，菌体生长量改变不明显。当液体培养基中Zn²⁺添加量由3ug/mL增加到8ug/mL时，转谷氨酰胺酶酶活迅速提高，由2.289U/mL提高至4.723U/mL，提高了2.06倍。

1.菌种

轮枝链霉菌SK4.001(江南大学食品科学研究室保存)

2.培养基组成

斜面培养基：高氏一号培养基

液体培养基：(g/L)甘油16-25蛋白胨15-30酵母浸膏1.6-2.5硫酸镁1.6-2.5磷酸氢二钾1.6-2.5

3.培养方法

以上各培养基均于121℃灭菌20min后使用，取一环新鲜斜面菌种，接入装有25mL液体培养基的250mL三角瓶中，在30℃、210rpm的条件下培养24h。以4％的接种量接入装有25mL液体培养基的250mL三角瓶中。在30℃、210rpm的条件下连续培养36-72h。

4.液体培养基中Zn²⁺的添加

利用原子吸收分光光度法测得起始液体培养基中Zn²⁺的含量在0.15ug/mL左右，分别加入不同量的ZnSO₄，使Zn²⁺添加量为3ug/mL-50ug/mL，则液体培养基中Zn₂₊的含量达到3.15ug/mL-50.15ug/mL。

5.乙二胺四乙酸二钠(EDTA)透析

室温下，25mL酶液在含10mmol/LEDTA、pH7.0的0.05mol/L三(羟甲基)氨基甲烷-HCL(Tris-HCL)缓冲液中透析2h，再在含1mmol/LEDTA的pH7.0、0.05mol/LTris-HCL缓冲液中于4℃透析过夜，然后在不含EDTA的pH7.0、0.05mol/LTris-HCL缓冲液中反复透析，脱去多余的EDTA和EDTA的螯合物。

分析方法

1.菌体量的测定

取5mL发酵液，离心，将沉淀部分加入30倍水和6mL 1M盐酸，激烈搅拌后，加4mL 1M氢氧化钠，离心(2500rpm，10min)，用水洗沉淀，用已恒重的滤纸过滤。置于100℃烘箱中加热至恒重。在干燥器中降至室温后称重，减去滤纸重量即为菌体干重。以mg/mL计。

2.转谷氨酰胺酶酶活测定

比色法测定：以CBZ-Gln-Gly为作用底物，以L-谷氨酸-γ-单羟氨酸作标准曲线.

酶活的定义：37℃、1min生成1umol L-谷氨酸-γ-单羟氨酸的量定义为一个酶活单位。

3.残余甘油测定

改进的多元醇比色法

Zn²⁺对轮枝链霉菌SK4.001培养的影响

1.对轮枝链霉菌SK4.001菌体生长的影响

表1.Zn²⁺添加量对细胞生长量的关系

由上表可以看出：Zn²⁺的添加量由0ug/mL增加到1ug/mL时，最大生物量增加很快，从10.23mg/mL增加到15.60mg/mL，超过50％。当Zn²⁺添加量加到3ug/mL时，最大生物量略有增长，达到16.99mg/mL。再进一步增加Zn²⁺浓度，最大生物量的改变并不明显。

2.对甘油消耗量的影响

Zn²⁺缺乏时，甘油的利用并不十分完全。发酵60h后，残余甘油的含量为2.56mg/mL。在起始液体培养基中加入Zn²⁺后，甘油的代谢利用率明显增加，Zn²⁺添加量为1ug/mL时，发酵36h后残余甘油的含量为0.076mg/mL。之后残余甘油含量相对稳定，维持在0.078mg/mL左右。Zn²⁺添加量为3、6、8、9ug/mL时的甘油代谢没有明显的区别，残余甘油含量均在32h左右达到最低，最低残余甘油含量维持在0.045mg/mL左右。

3.对pH的影响

Zn²⁺缺乏时，pH呈下降趋势，改变幅度不大。含有Zn²⁺时，发酵液的pH变化规律表现为先下降后上升的趋势，不同Zn²⁺含量间的区别并不明显。

4.对轮枝链霉菌SK4.001产转谷氨酰胺酶的影响

表2.Zn²⁺添加量对转谷氨酰胺酶酶活的影响

当Zn²⁺缺乏时，轮枝链霉菌SK4.001对甘油的利用不完全，pH变化异常，SK4.001的代谢是病态的，不产转谷氨酰胺酶。Zn²⁺添加量为1ug/mL时，SK4.001代谢正常，但酶活很低，随着Zn²⁺含量的增加，酶活也随之增加。当Zn²⁺添加量达到8ug/mL时，酶活达到最高。进一步增加Zn²⁺含量，酶活的改变并不很明显。

5.螯合剂EDTA透析对转谷氨酰胺酶酶活的影响

表3.EDTA透析对转谷氨酰胺酶酶活的影响

结果表明EDTA对酶活并无明显负面影响，酶活的稍许下降与发酵液的不同保存环境及检测时的误差有关。

综上结果，欲保证SK4.001的正常生长，并获得较高的生物量，发酵培养基中Zn²⁺的含量不应低于3ug/mL。进一步增加Zn²⁺的含量可提高转谷氨酰胺酶的酶活。8ug/mL的添加量可获得最高的酶活，达到4.723U/mL。

Zn²⁺在SK4.001发酵生产转谷氨酰胺酶中的作用可分为二：其一，作为一种营养成分满足SK4.001菌体生长的需要；其二，具有促进SK4.001产转谷氨酰氨酶的作用。

金属离子常在酶蛋白中起到稳定结构和作为活性中心的作用，或兼而有之。Zn²⁺在生物大分子中与肽链作用形成稳定的共价化合物十分常见。但发酵液的EDTA透析表明，转谷氨酰胺酶的酶活并没有受到EDTA的明显影响，即Zn²⁺并不是转谷氨酰胺酶的构成部分或活性中心。

Zn²⁺能抑制转谷氨酰氨酶的活性，酶液中含有1mmol/L的Zn²⁺时，85％的酶活被抑制。故而推测发酵培养中酶活的增加是因为酶产量的增加，而非Zn²⁺对酶活性的调控。

本发明的有益效果

Zn²⁺在轮枝链霉菌SK4.001生产转谷氨酰氨酶的液体培养基中含量为3.15ug/mL时，即可获得较高菌体量，为16.9.9mg/mL。进一步提高Zn²⁺的含量，相对于Zn²⁺含量为3.15ug/mL时而言，菌体量增加不明显，但转谷氨酰氨酶的酶活迅速提高。发酵培养基中Zn²⁺的添加量为8ug/mL时，转谷氨酰氨酶的酶活可达到4.723U/mL，是Zn²⁺添加量为3ug/mL时的2.06倍。其它金属离子的拮抗作用对Zn²⁺的吸收及产酶的促进作用没有负面影响，可以确定Zn²⁺不是转谷氨酰胺酶的组成部分或活性中心，其对SK4.001产微生物转谷氨酰胺酶的促进机理有待进一步研究。

具体实施方式

实施例1

轮枝链霉菌(Streptoverticillium)SK4.001为生产菌种，液体培养基组成为上述组成，添加ZnSO₄于液体培养基中，使其中Zn²⁺添加量为3ug/mL，培养基于121℃灭菌20min后使用，取一环新鲜斜面菌种，接入装有25mL液体培养基的250mL三角瓶中，在30℃、210rpm的条件下培养24h。以4％的接种量接入25mL液体培养基中，在30℃、210rpm的条件下连续培养60h，得最大细胞干重16.99mg/mL，转谷氨酰胺酶酶活为2.289U/mL。

实施例2

添加ZnSO₄于液体培养基中，使其中Zn²⁺添加量为8ug/mL，其余操作同实施例1，得最大细胞干重17.11mg/mL，转谷氨酰胺酶酶活为4.723U/mL。