一种利用膜分子gp130激活细胞生理调节机制筛选的激素的拮抗剂和超拮抗剂

本发明涉及一种利用膜分子gp130激活细胞生理调节机制筛选的激素的拮抗剂和超拮抗剂。

正如人们所知，授予Genentec Inc.公司的专利WO 92/21029公开了一种测定生长激素和具有类似结构构象的配位体的激动剂或拮抗剂的方法。将可能的激动剂和拮抗剂与该激素的受体接触，这将引起三元复合物的形成，该三元复合物包括一分子可能的激动剂或拮抗剂和两分子所要被激动或拮抗的激素的受体。由配位体分子诱导的受体的二聚化说明该配位体具有两个不同的反应位点(位点1和位点2)，在这些位点上进行诱变处理即有可能产生激动剂或拮抗剂。

现已惊奇地发现，类似于白细胞介素6(IL-6)的一组细胞激动素，即制癌蛋白M(OSM)、白血病抑制因子(LIF)、睫亲神经因子(CNTF)及白细胞介素11((IL-11)的配位体，诱导了受体复合物的形成，而膜分子gp130是其一部分。在该受体复合物中，这些细胞激动素的专一受体和膜分子gp130始终是作为共同成分存在。因此，有可能得出如下假定：在这类激素中位点1和位点2与两种不同的分子结合：位点1与专一受体结合，位点2与gp130结合。

从下面的叙述中可以更清楚地看出，通过根据人生长激素受体(hGH)序列与所要研究的激素的受体序列之间的功能相似性构建受体复合物的三维模型，有可能对两种位点进行鉴定。通过构建携带了既包括野生型也包括突变型激素的丝状噬菌体库(如M13)，可对相对于野生型激素对专一受体具有更大亲和性的突变体(超激动剂或超拮抗剂)进行分离。

这里的IL-6及WO 92/21029中所举例子的三维模型之间的差别导致以下假设：螺旋A和C中的不同残基组成了位点2。

按如下方式对人白细胞介素6分子进行模拟。从科学文献中所能获得的数据中知道，人白细胞介素6属于这样一类细胞激动素：它具有四个螺旋，这些螺旋形成了其三维结构的核心。对人白细胞介素6的氨基酸序列进行分析以鉴定出最有可能形成螺旋的四个区。在下一阶段，在计算机化的相互作用的图解单元中对白细胞介素6分子的这四个螺旋进行模拟。开始，假定四个螺旋的定向与在生长激素或巨噬粒细胞集落刺激因子等激素中所看到的类似。为了将疏水氨基酸以最佳方式包褒在四个螺旋之间的空间中，对螺旋的相对位置进行调整。然后，模拟连接四个螺旋的环。

该白细胞介素6的三维模型保证了人白细胞介素6和其两个受体：低亲和性受体gp80(位点1)和gp130信号转导的高亲和性受体(位点2)之间相互反应的两个位点的鉴定。利用下述方法鉴定这两个位点。通过比较序列发现，一族造血受体的所有成员均具有一共同区域，称为细胞激动素识别区。这种序列上的相似性也说明包括两种白细胞介素6受体gp80和gp130在内的各种受体的相应部分很可能具有结构上的相似性。与这些受体结合的细胞激动素均具有(或可预测有)一种为四螺旋基质的相似结构这一观察结果强有力地支持这一假定：通过细胞激动素识别区进行的这些细胞激动素及其受体之间的反应，在生物活性的复合物中一定非常类似。

鉴于已通过X-射线结晶法测定了这类化合物之一(由生长激素和生长激素的二聚受体的胞外区构成的复合物)的三维结构，我们的人白细胞介素6模型使我们能够鉴定出白细胞介素6与其两个受体gp80(位点1)和gp130(位点2)反应的可能位点。它是通过与涉及生长激素的复合物相比较并假定功能上重要的氨基酸位于两种激素表面上相似的位置而实现的。

下面以白细胞介素6为例，解释提供一种生产其受体复合物包括gp130的免疫系统激素的激动剂、拮抗剂和超拮抗剂的方法的必要性。

已知白细胞介素6是一种184个氨基酸的多肽，它属于螺旋细胞激动素类。白细胞介素6是一种由各种类型的细胞产生的多功能的细胞激动素。在例如免疫系统中的细胞、肝细胞、肾细胞、造血细胞、角质化细胞及神经元等各种类型的细胞上，白细胞介素6的功能是作为分化和生长因子。

白细胞介素6的超激动剂的产生将使及在各种严重疾病的治疗中可使用比野生型白细胞介素6更低的治疗剂量。事实上，白细胞介素6在治疗乳腺癌、白血病、传染病或与产生骨髓的细胞紊乱有关的疾病方面具有重要和有希望的应用价值。

另一方面，在其特征是白细胞介素6过量产生的各种疾病，如慢性自体免疫疾病、骨髓瘤/浆细胞瘤、经绝后骨质疏松症和癌血症中，人白细胞介素6的拮抗剂或超拮抗剂的产生将抑制白细胞介素6。

本发明筛选利用膜分子gp130激活细胞生理调节机制的激素的超激动剂、拮抗剂或超拮抗剂的方法包括下列步骤：

—比较生长激素的氨基酸序列与该激素的序列；

—比较生长激素受体的氨基酸序列与所研究激素的两种受体即激素专一性受体和gp130的序列；    

—在上述比较的基础上，根据生长激素受体和所研究的两种激素受体序列之间的功能相似性，构建受体复合物的三维模型；及

—鉴定出分别为与专一受体反应的位点的一部分和与gp130反应的位点的一部分的野生型所研究激素的残基。

所研究的激素可选自：白细胞介素6(IL-6)、制癌蛋白M(OSM)、白血病抑制因子(LIF)、睫亲神经因子(CNTF)和白细胞介素11(IL-11)。

为了筛选白细胞介素6的超激动剂，本发明的方法进一步包括下列附加步骤：

一产生一系列噬菌体库，它们含有以与丝状噬菌体蛋白融合的形式存在的白细胞介素6的下列野生型残基的突变：Glu 42，Glu 51，Ser 52，Ser 53，Lys 54，Glu 55，Asn 63，Lys 66，Met 67，Ala 68，Glu 69，Lys 70，Asp 71，Phe170，Gln 175，Ser 176，Ser 177，Leu 181，Gln 183；    

—产生其每一噬菌体均具有突变的白细胞介素6序列的噬菌体库；

—从表达白细胞介素6突变体的噬菌体混合群体中筛选出其对专一受体的亲和性大于野生型白细胞介素的噬菌体；

—通过对从筛选的噬菌体颗粒提取的DNA进行测序而鉴定出结合受体的最佳氨基酸序列；

在这种情况下，可产生一系列噬菌体库，它们含有以与M13的蛋白质pIII融合的产物形式存在的白细胞介素6的所述野生型残基的突变。

本发明筛选白细胞介素6的拮抗剂的方法除包括上面所述的操作外还包括如下操作步骤：

—利用常规分子生物学技术对所研究激素的野生型残基进行突变，形成与gp130反应的部分位点(Arg30，Tyr31，Gly35，Ser37，Ala38，Ser118，Lys120，Val121，Gln124，Phe125，Gln127，Lys128和Lys129)；

—对上面产生的突变体的生物活性及其与专一白细胞介素6受体的亲和性进行评估，以鉴定出其与专一受体的亲和性完整而其生物活性降低或丧失的白细胞介素6的变异体；

—对作为拮抗剂的上述白细胞介素6的变异体的野生型白细胞介素6生物活性进行评估。

在筛选白细胞介素6的超拮抗剂时，是将上面所述的负责拮抗剂活性的氨基酸序列的改变与负责提高白细胞介素6的专一受体的亲和性的氨基酸的改变相结合。

在筛选白细胞介素6的拮抗剂或超拮抗剂的方法中，可选择下列分子生物学技术对上面所鉴定的残基进行诱变：聚合酶链反应、引物延长、寡核苷酸定点诱变及其组合。

本发明并不限于筛选白细胞介素6的激动剂、拮抗剂或超拮抗剂。相反，它扩展到利用膜分子gp130激活细胞生理调节机制的激素的激动剂、拮抗剂和超拮抗剂，这一目的是通过利用上面所述的筛选方法达到的。

至此，已给出了对本发明主题的一般描述。下面将借助实施例更详细地描述本发明的具体实施方案，其目的在于更好地理解本发明的目的、特征、优点及其应用方法。

图1显示了pHenΔhIL-6的构建及用于筛选hIL-6的激动剂的噬菌质颗粒的产生(见实施例1“载体构建”)。

图2显示了随着其浓度提高的突变体IL-6 Tyr31/Asp/Gly35Phe/Ser118 Arg/Val 121 Asp的拮抗活性的变化。

保藏

大肠杆菌K12-被质核pHenΔhIL-6转化，从识别限制酶Sal I的位点至识别限制酸NotI的位点插入的该质粒含有编码野生型人白细胞介素6的氨基酸序列的核苷酸序列—已于10/6/1993保藏于The National Collection of Industrial and Marine Bacteria Ltd.(NCIMB，Aberdeen，Scotland，Uk)，其保藏编号为NCIMB 40563。

实施例1

本发明的方法用于筛选白细胞介素6的激动剂

1)载体构建

所使用的策略包括构建一种杂交基因，它含有所有hIL-6编码区，在其后面的则是噬菌体M13的蛋白质pIII的最后157个氨基酸，而在其前面的则是序列Pel B，它将所合成的蛋白质运载至浆膜外周间隙。

杂交基因的表达由启动于lacz启动。构建是在载体PHenΔe的基础上进行，且取名为pHenΔhIL-6(见唯一的附图)。该质粒也含有噬菌体复制起点。如果被称为“助手”的噬菌体(如M13K07)感染了含有该质粒的细菌细胞，则该质粒将产生单丝拷贝，且该单丝拷贝将会象真正的噬菌体基因组那样被噬菌体蛋白所包裹。这些含有质粒的噬菌体颗粒被称为噬菌质(phasmids)。除了正常的PIII分子外，它们也含有hIL6-pIII融合分子，因此，hIL-6分子及编码其氨基酸序列的基因包含在同一单位中。在突变分子的情况下，将有可能简单地通过质粒DNA测序测定出暴露在由上述筛选方法获得的噬菌体表面上的分子的氨基酸序列。

构建pHen hIL-6的另一个特征是在IL-6基因和pIII基因之间存在转译终止密码。该杂交蛋白质的产生是在能够抑制该终止密码的细菌菌株中进行。相反，使用非抑制菌株将直接在浆膜外周间隙中单独产生hIL-6。

下面的实验说明，利用ShrIL-6R，通过扩增筛选循环从暴露在利用pHenhI1-6的噬菌体上的大量突变白细胞介素-6中纯化与所说受体具有更大亲和性的突变体的能力。

2)系统鉴定实验

a)ELISA试验

在ELISA平板的孔中涂上hIL-6质粒或M13K07质粒，并使其与shrIL-6R(可溶性人重组IL-6R)反应。反复洗涤后，利用与碱性磷酸酶连接的专一单克隆抗体证实受体的存在。所获得的信号大于hIL-6质粒，且随所用受体量的增加而增加。

b)利用shrhIL-6R从与质粒K07的混合物中富集hIL-6质粒

按1∶100的比例混合hIL-6质粒颗粒和M13K07颗粒。将该混合物与涂有shrIL-6R的聚苯乙烯珠一起保温。于中性pH下反复洗涤后，将珠于pH4.2下充分洗涤，然后于pH3.6洗脱。测定所得洗洗脱液中hIL-6质粒：M13K07的比例，发现它为1∶10，结果是与M13K07相比hIL-6质粒富集了10倍。

c)从突变白细胞介质素6的混合物中筛选对受体gP80具有最高亲和性的突变体

产生在其表面具有hIL-6突变分子的质粒颗粒，该突变体与天然情况相比具有较高(176Arg)或较低(179Ala)受体亲和性。将这些颗粒按1∶1的比例混合。将该混合物与受体一起在一固相中保温(见b)所述)。在pH3.6的洗脱液中，两类颗粒的比例为15∶1，176Arg占多数。

d)测定M13K07、hIL-6质粒、176Arg质粒和179Ala质粒颗粒对受体gp80的相对亲和性

将等量的上面所列举的各种类型的颗粒单独与涂有受体的珠一起保温。经常规洗涤程序后，测定从每类噬菌体的pH3.6洗脱液中回收的颗粒数。以从质粒hIL-6质粒中回收的颗粒值作为1，则所获得的176Arg值为3，179Ala值为0.2，M13K07值为0.8。这些值反映了未暴露在噬菌体上的IL-6分子的相对亲和性。事实上，由此可知，176Arg给合受体的亲和性要比天然分子大三倍，而179Ala对受体的亲和性几乎降至零(事实上具有这种突变的质粒在与受体结合方面类似于M13K07)。这组实验已说明，有可能利用本发明的方法从暴露于噬菌体上的突变体混合物中筛选出对受体具有最大亲和性的突变性。

实施例2

利用本发明的方法产生和筛选白细胞介素6的拮抗剂

以质粒PhenΔhIL-6作为所有诱变反应的模板。该质粒为pHEN1质粒的衍生物，且含有人IL-6编码区(SEQ ID NO：1)及其下游的噬菌体M13的PIII蛋白羧基末端部分(从密码250至COOH末端)编码区；这两个编码区位于阅读框架中并由Amber UAG终止密码子隔开，该密码子可被其基因组中整合了压制基因SupE的细菌菌株压制。人IL-6编码区也位于阅读框架中，在肽PelB(一种分泌信号序列)之下，且整个该基因由启动子lacZ控制。最后，在编码hIL-6的氨基酸20-21-22的核苷酸序列处引入限制酶SacI的单一位点而不改变其同一性，同样，在hIL-6的氨基酸38-39-40编码区引入限制酶BfrI的单一位点而不改变它们。

利用PCR方法(聚合酶链反应)在人白细胞介6编码区内选择的密码子处产生突变。引物下游为H9，它为一种32核苷酸引物，对应于hIL-6 cDNA的位置426-457(反义细丝)(取成熟多肽的第一个密码子的第一个核苷酸为1)。引物杂交位点位于天然存在于cD-NA中的酶xbaI识别位点下游。诱变引物上游为IL-6 31D/35PCR，它是一种70核苷酸引物，其序列为SEQ ID No：2。

引物IL-6 31D/35 PCR从hIL-6 cDNA的位置55延伸至124(有意义丝)并引起编码氨基酸31(野生型Tyr)和35(野生型Gly)的密码子变性。按照标准PCR扩增方法扩增403对碱基的DNA片段。扩增通过35次循环完成。每一循环包括于94℃保温2分钟使模板变性，于50℃保温2分钟使寡核苷酸杂交，及于72℃保温3分钟使链延长。用SacI和xbaI消化扩增片段，并用2％琼脂糖凝胶纯化。将通过PCR产生并被上述两种酶消化的片段与同样被这两种酶消化并在0.8％琼脂糖凝胶上纯化的载体pHen hIL-6连接，以取代野生型序列。

下面的表1显示了野生型白细胞介素6及其突变体在人肝细胞瘤细胞中的生物活性及与受体gp80的结合，突变处用星号标出。

表1

野生型白细胞介素6及其螺旋A突变体的受体结合性和生物活性

从上可以看出，与野生型白细胞介素6相比突变体(Tyr 31 Asp，Glg 35 Tyr)、(Tyr 31 Asp，Gly 35 Phe)和(Tyr 31 Asp，Gly 35 Leu，Glu 42 Ala)显示出较低的生物活性。在所有这些情况下，残余活性为野生型白细胞介素6的2-5％。这三个突变体维持了与白细胞介素6受体gp80结合的全部能力。总之，这三种突变体在肝细胞瘤细胞中的信号转导活性降低，换之言，它们是野生型白细胞介素6的拮抗剂。具体地，突变体(Tyr 31 Asp，Gly 35 Phe)是尤其有效的拮抗剂，因为当以50倍摩尔过量使用于肝细胞瘤细胞试验时它能够降低野生型白细胞介素-6的活性。

实施例3

利用本发明的方法产生和筛选白细胞介素6的其它拮抗剂

以前一实施例中所述的质粒pHenΔhIL-6作为所有诱变反应的模板。利用PCR法(聚合酶链反应)在人白细胞介素6编码区内选定的密码子上产生突变。引物为HP/1，它是一个具有29个核苷酸、对应于hIL-6 cDNA的位置1-19(有意义丝)(取成熟多肽的第一密码子的第一个核苷酸为1)的引物。引物杂交位点位于酶SacI识别位点上游，该识别位点如实施例2中所述被人工引入cDNA，而不改变由后者编码的序列。位于诱变引物之下的是IL-6 118 RCLF/121 VD，它是一个72核苷酸引物，其序列为SEQ ID No.3。

引物IL-6 118 RCLF/121 VD从hIL-6 cDNA的位置334延伸至位置405(反义丝)并引起编码氨基酸118(野生型Ser)和121(野生型Val)的密码子的变性。利用标准的PCR扩增法扩增有415对碱基的DNA片段，扩增通过35次循环完成。每一循环包括于94℃保温2分钟以使模板变性、于50℃保温2分钟以使寡核苷酸杂交和于72℃保温3分钟以延长链。用SacI和xbaI消化扩增后的片段，并用2％琼脂糖凝胶纯化。将通过PCR产生并用两种酶消化的片段连接至被同样两种酶消化并在0.8％琼脂糖胶上纯化的载体pHenΔhIL-6中，以取代野生型序列。

下面的表2显示了野生型白细胞介素6和在所示残基处发生突变的突变体在人肝细胞瘤细胞中的生物活性及与受体的结合性。

表2

野生型白细胞介素6及其螺旋C

突变体的受体结合性和生物活性

可以看出，突变体IL-6 Ser 118 Arg/val 121 Asp具有非常类似于表1所述突变体IL-6 Tyr 31 Asp/Gly 35 Phe的特征，即它能与白细胞介素6的I型受体正常结合，但其细胞激动素活性约降低了30倍。

实施例4

利用本发明方法产生和筛选白细胞介素6的更强拮抗剂

在这一实施例中，是以实施例2中所获得的质粒pHenΔhIL-6Tyr 31 Asp/Gly 35 Phe作为所有突变反应的模板。

利用PCR法(聚合酶链反应)在人白细胞介素6编码区中选定的密码子上产生突变。上面的引物为前一实施例中所述的HP/1。诱变引物下面是也在前一实施例中所述的IL-6 118 RCLF/121 VD。按照标准PCR扩增法扩增有415对碱基的DNA片段。扩增通过35个循环完成。每一循环包括于94℃保温2分钟以使模板变性、于50℃保温2分钟以使寡核苷酸杂交及于72℃保温3分钟以使链延长。用SacI和xbaI消化扩增的片段并用2％琼脂糖凝胶纯化。将通过PCR产生并被两种酶消化的片段与被同样两种酶消化并在0.8％琼脂糖凝胶上纯化的载体pHenΔhIL-6连接，以取代野生型序列。

下面的表3显示了野生型白细胞介素-6及其在所示残基上发生突变的各种突变体在肝细胞瘤细胞中的生物活性及受体结合性。

                         表3

野生型白细胞介素6及其螺旋A和C突变体的

          受体结合性和生物活性

N.D.＝未测定

在螺旋A和C上均发生突变的三个变异体均未在人肝细胞瘤细胞中显示出生物活性的迹象，而维持了它们与受体gp80结合的能力。在这三种蛋白质中，选择突变体IL-6 Tyr 31 Asp/Gly 35 Phe/Ser 118 Arg/Val 121 Asp与野生型白细胞介素6在人肝细胞瘤细胞中的生物活性进行竞争实验。在不断提高突变物浓度的情况下，以4毫微克白细胞介素6/毫升培养基(ng/ml)刺激细胞。如图2所示(其中野生型白细胞介素6的生物活性以任意单位表示)，随着突变物浓度的不断提高，最终完全拮抗了野生型白细胞介素6对人肝细胞瘤细胞的作用。

表4显示了依据拮抗剂的浓度(分别以ng/ml，相对于野生型白细胞介素6的摩尔过量和nmole/l表示)的抑制野生型白细胞介素6的生物活性的水平(％)。

                              表4

              根据拮抗剂浓度产生的野生型白细胞介素6

                         生物活性的抑制

实施例5

利用本发明方法产生和筛选的白细胞介素6拮抗剂抑制白细胞介素6依赖性人骨髓瘤细胞的生长

在前一实施例中，已证实突变体之一，即IL-6 Tyr 31Asp/Gly35 Phe/Ser 118 Arg/Val 121 Asp能够抑制白细胞介素6对人肝细胞瘤细胞的生物活性(通过白细胞介素6诱导的启动子刺激转录)。在本申请的前序部分已指出，开发白细胞介素6拮抗剂或超拮抗剂具有实际应用，因为在其特征是白细胞介素6过量产生的疾病如各种形式的多发性骨髓瘤/浆细胞瘤中可用它们抑制白细胞介素6活性。我们在这里再提供一实例以证实下列三个突变体能够完全抑制白细胞介素6依赖性的人骨髓瘤细胞系xG-1的生长：

IL-6 Tyr31Asp/Gly35Phe/Ser118Arg/Val121Asp(DFRD)，

IL-6 Tyr31Asp/Gly35Phe/Ser118Phe/Val121Asp(DFFD)，

IL-6 Tyr31Asp/Gly35Phe/Ser118Leu/Val121Asp(DFLD)

xG-1得自从晚期患者的骨髓瘤细胞中刚刚分离的细胞。与新鲜骨髓瘤细胞所示情况类似，xG-1骨髓瘤细胞系的生长严格地依赖于外源加入的白细胞介素6，因此该细胞系可被认为是多发性骨髓瘤疾病的良好体外模型(Jourden，M.，Zhang，x-G，Portier，M.Boiron，J.-M.，Bataille，R.and Klein，B(1991)J.lmmunol.147，4402-4407)。为了试验突变物对野生型白细胞介素6的拮抗作用，将xG-1骨髓瘤细胞按6000细胞/微孔的浓度培养于96孔微滴定板上，且其中野生型白细胞介素6的浓度为0.1ng/ml，而三种突变体的浓度则不断提高。培养7天后，通过比色测定氨基己糖苷酶水平(Lan-degren，u，(1984)J.Innunol Methods 67，379-388)评价细胞数。下面的表5显示了对野生型白细胞介素6活性的抑制作用与三种拮抗剂浓度(以每毫升培养基中突变物的毫微克表示)的函数关系。

                         表5

    野生型白细胞介素6活性(刺激XG-1人骨髓瘤细胞

          生长)抑制与三种拮抗剂浓度的关系

从上表可以看出，所有突变物均是白细胞介素6对人骨髓瘤细胞生物活性的非常有效的拮抗剂。

实施例6

应用本发明的方法筛选新的白细胞介素6超激动剂

利用引物延长分子生物学技术构建噬菌体库(含有野生型白细胞介素6的残基Gln 175、Ser177、Leu 181和Leu 183突变，以与丝状噬菌体蛋白融合的产物形式存在)。突变寡核苷酸为IL-6 QSLQ(AS)，它为一种62核苷酸寡聚物，其序列为SEQ ID No：4。引物IL-6 QSLQ(AS)从白细胞介素6 cDNA(反义链)的位置507延长至终止密码子，它引起编码氨基酸175(野生型Gln)、177(野生型Ser)、181(野生型Leu)和183(野生型Gln)的密码子的变性，并在白细胞介素6终止密码子的下游引入了Not I限制位点。利用其序列为SEQ ID No：5的寡核苷酸IL-6 QSLQ pr.Bam作为引物延长反应的引物。寡核苷酸IL-6 QSLQ pr.Bam从白细胞介素6 cDNA的位置503延长至522(有意义链)，且在其5’端九核苷酸中含有Bam HI限制位点。这两个寡核苷酸在对应于白细胞介素6 cDNA的位置507-522的区域上相互互补。将这两种寡核苷酸体外退火，并用退火后的寡核苷酸作为引物延长反应(利用Klenow酶进行)的底物，然后将由此获得的双链DNA片段用Bam HI(与BgIII相容)和Not I消化，并连接至用BglII(与BamHI相容)和NotI消化的质粒phenΔhIL-6上，以用突变序列取代野生型序列。将连接产物插入细菌，产生约一百万个独立的转化体(“转化体”是对加进了重组质粒的细菌的定义)。用M13K07助手噬菌体感染转化的细菌，如实施例1所述产生噬菌体库(质粒库)。

如实施例1所述，通过与包裹shrIL-6R的聚苯乙烯珠一起保温筛选该库。于pH3.6洗脱噬菌体群体，然后在细菌中扩增。经五次筛选-扩增循环后，对任选噬菌体的突变区进行测序。在合适的细菌菌株的浆膜外周间隙中产生相应的突变白细胞介素6蛋白(如实例1所述)，并测试其受体结合性及在人肝细胞瘤细胞上的生物活性。下表6说明，通过利用本发明的方法就有可能筛选出白细胞介素6的超激动剂，它们是一些在人肝细胞瘤细胞上的受体结合性和生物活性均得到提高的突变分子。

                          表6

          野生型白细胞介素6和其螺旋D突变体的

                 受体结合性和生物活性

利用本发明的方法筛选的突变体可作为开发更有效的白细胞介素6超激动剂的起点。这一点可从本实施例中看出，其中将在噬菌体5-2中鉴定出的突变与突变体Ser 176 Arg相结合，现有技术中已知后一突变体既提高了受体结合性也提高了生物活性(见由本申请人于93.11.2提交的PCT申请的国际公开WO 94/11402，其优先权日为92.11.6)。通过针对寡核苷酸的诱变使三种突变分组在同一cDNA上。寡核苷酸175 I/176R/183A(S)(其序列为SEQ ID No：6)有73个核苷酸长，它从存于phen hIL-6中的白细胞介素6 cDNA的位置499延伸至终止密码子(有意义链)且在其终止密码子下游有-Not I酶识别位点。其序列为SEQ ID No：7的寡核苷酸175I/176R/183A(AS)为73个核苷酸长的核苷酸，它从存在于phenΔhIL-6中的白细胞介素6cDNA的位置499延伸至终止密码子(反义链)且在终止密码子的上游有-NotI酶识别位点。这两个寡核苷酸彼此互补，且它们均在位置175处编码异亮氨酸(ILe)、在176处编码丝氨酸(Ser)及在183处编码丙氨酸(Ala)，将这两种寡核苷酸体外退火，由此获得的双链DNA片段用限制酶BglII和NotI消化，并连接至被同样的两种酶消化的载体phenΔhIL-6中，以用突变序列取代野生型序列。在合适的细菌菌株的浆膜外周间隙中产生携带了三种所需突变的相应白细胞介素6变异物(如实施例1所述)，并测试其在人肝细胞瘤细胞上的受体结合性和生物活性。下面的表7显示了新的三突变体和原来的双突变体在人肝细胞瘤细胞上的受体结合性和生物活性。    

                          表7

      野生型白细胞介素6和螺旋D中的双突变和三突变

               物的受体结合性和生物活性

从上表可以看出，与仅携带两取代物Gln 175 Ile/Gln.183 Ala的亲代突变体相比，携带了取代物Gln 175 Ile/Ser 176 Arg/Gln 183 Ala的突变体是更有效的白细胞介素6超激动剂。

实施例7

应用本发明的方法筛选白细胞介素6的超拮抗剂

通过PCR法，将实施例6中所鉴定的受体结合能力大大提高的三突变体Gln 175 Ile/Ser 176 Arg/Gln 183 Ala与实施例4和5所述的显示出最强拮抗能力的四突变体Tyr 31 Asp/Gly 35 Phe/Ser118Arg/Val 121 Asp结合。相应的突变蛋白称为SAnt1，它含有所有七种突变，对其受体结合性及在人肝细胞瘤细胞和骨髓瘤细胞上的拮抗活性均进行了试验。下面的表8显示了SAnt1和DFRD(产生SAnt1的突变体)的受体结合性以及抑制白细胞介素6生物活性50％所需的突变体的量(每毫升培养基的突变物毫微克数)(用4ng野生型白细胞介素6/ml培养基刺激肝细胞瘤细胞，用0.1ng白细胞介素6/ml培养基刺激骨髓瘤细胞，因为后者对野生型白细胞介素6更敏感)。

                                     表8

       对野生型白细胞介素6在人肝细胞瘤和骨髓瘤细胞上的活性的抑制作用

                          与拮抗剂受体结合能力的关系

从上表可以看出，实施例6所述的三突变(Gln 175 Ile/Ser 176Arg/Gln 183 Ala)的引入立即增加了亲代突变体DFRD的受体结合能力，并大大降低了50％抑制白细胞介素6在所有试验细胞系上的生物活性所需的拮抗剂的量，从而产生非常有效的白细胞介素6超拮抗剂。

                        序列表

                        总信息

(i)申请人：ISTITUTO DI RICERCHE DI BIOLOGIA MOLECO-LARE P.ANGELETT1 S.P.A.

(ii)发明名称：以GP130作为其受体一部分的激素的超激动剂、拮抗剂和超拮抗剂的筛选方法

(iii)序列数：7

(iv)相关地址

    (A)收信人：Societa Italiana Brevetli

    (B)衔道：Piazza de Pietra，39

    (C)城市：罗马

    (D)国家：意大利

    (E)邮政编码：I-00186

(viii)代理人信息  

    (A)姓名：ID CERBO，Mario(Dr.)

    (C)卷号：RM/090075/MDC

(ix)通信信息

    (A)电话：06/6785941

    (B)传真：06/6794692

    (C)电传：612287 RORAT

(1)SEQ ID No：1的信息

    (i)序列特征

        (A)长度：555对碱基

        (B)类型：核苷酸

        (C)链性：双链

        (D)拓扑性：线性

    (ii)分子类型：cDNA

    (iii)假定：无

    (iv)反义：无

    (v)片段类型：内在的

    (vii)直接来源

        (A)合成：在细菌中产生

    (ix)其它特征

        (A)名称：IL-6 cDNA

        (C)鉴定方法：聚丙烯酰胺凝胶

    (xi)序列描述：SEQ ID NO：1

CCA GTA CCC CCA GGA GAA GAT TCC AAA GAT GTA GCC GCC CCA CAC AGA         48

Pro Val Pro Pro Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala Pro His Arg

1               5                   10                  15

CAG CCA CTC ACG AGC TCA GAA CGA ATT GAC AAA CAA ATT CGG TAC ATC         96

Gln Pro Leu Thr Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Tyr Ile

            20                  25                  30

CTC GAC GGC ATC TCA GCC TTA AGA AAG GAG ACA TGT AAC AAG AGT AAC         144

Leu Asp Gly Ile Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn

        35                  40                  45

ATG TGT GAA AGC AGC AAA GAG GCA CTG GCA GAA AAC AAC CTG AAC CTT         192

Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu

    50                  55                  60

CCA AAG ATG GCT GAA AAA GAT GGA TGC TTC CAA TCT GGA TTC AAT GAG         240

Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu

65                  70                  75                  80

GAG ACT TGC CTG GTG AAA ATC ATC ACT GGT CTT TTG GAG TTT GAG GTA         288

Glu Thr Cys Leu Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val

                85                  90                  95

TAC CTA GAG TAC CTC CAG AAC AGA TTT GAG AGT AGT GAG GAA CAA GCC         336

Tyr Leu Glu Tyr Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala

            100                 105                 110

AGA GCT GTC CAG ATG AGT ACA AAA GTC CTG ATC CAG TTC CTG CAG AAA         384

Arg Ala Val Gln Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys

        115                 120                 125

AAG GCA AAG AAT CTA GAT GCA ATA ACC ACC CCT GAC CCA ACC ACA AAT         432

Lys Ala Lys Asn Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn

    130                 135                 140

GCC AGC CTG CTG ACG AAG CTG CAG GCA CAG AAC CAG TGG CTG CAG GAC         480

Ala Ser Leu Leu Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp

145                 150                 155                 160

ATG ACA ACT CAT CTC ATT CTG AGA TCT TTT AAG GAG TTC CTG CAG TCC         528

Met Thr Thr His Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser

               165                  170                 175

AGC CTG AGG GCT CTT CGG CAA ATG TAG                                     555

Ser Leu Arg Ala Leu Arg Gln Met

            180

(2)SEQ ID No：2的信息

    (i)序列特征

        (A)长度：70对碱基

        (B)类型：核苷酸

        (C)链性：单链

        (D)拓扑性：线性

    (ii)分子类型：合成DNA

    (iii)假定：无

    (iv)反义：无

    (v)片段类型：内在的

    (vii)直接来源

        (A)合成：寡核苷酸合成仪

    (ix)其它特征

        (A)名称：IL-631 D 35 PCR

        (C)鉴定方法：聚丙烯酰胺凝胶

    (xi)序列描述：SEQ ID NO：2

CGCACGAGCT CAGAACGAAT TGACAAACAA ATTCGGKACA TCCTCGACYD TATCTCAGCC   60

TTAAGAAAGG                                                          70

(3)SEQ ID No：3的信息

    (i)序列特征

        (A)长度：72个核苷酸

        (B)类型：核苷酸

        (C)链性：双链

        (D)拓扑性：线性

    (ii)分子类型：合成DNA

    (iii)假定：无

    (iv)反义：有

    (v)片段类型：内在的

    (vii)直接来源

        (A)合成：寡核苷合成仪

    (ix)其它特征

        (A)名称：IL-6 118 RCLF/121VD

        (C)鉴定方法：聚丙烯酰胺凝胶

    (xi)序列描述：SEQ ID NO：3

CGCATCTAGA TTCTTTGCCT TTTTCTGCAG GAACTGGATC AGGWCTTTTG TGMRCATCTG     60

CACAGCTCTG GC                                                         72

(4)SEQ ID No：4的信息

    (i)序列特征

        (A)长度：62个核苷酸

        (B)类型：核苷酸    

        (C)链性：单链

        (D)拓扑性：线性

    (ii)分子类型：合成DNA

    (iii)假定：无

    (iv)反义：有

    (v)片段类型：羧基末端

    (vii)直接来源

         (A)合成：寡核苷酸合成仪

    (ix)其它特征

        (A)名称：IL-6 QSLQ(AS)

        (C)鉴定方法：聚丙烯酰胺凝胶

    (xi)序列描述：SEQ ID NO：4

CCGGGCGGCC GCCCTACATM NNCCGMNNAG CCCTCAGMNN GGAMNNCAGG AACTCCTTAA    60

AG                                                                   62

(5)SEQ ID No：5的信息

    (i)序列特征

        (A)长度：24个核苷酸

        (B)类型：核苷酸

        (C)链性：单链

        (D)拓扑性：线性

    (ii)分子类型：合成DNA

    (iii)假定：无

    (iv)反义：无

    (v)片段类型：内在的

    (vii)直接来源

        (A)合成：寡核苷酸合成仪

    (ix)其它特征

        (A)名称：IL-6 QSLQ pr.Bam

        (C)鉴定方法：聚丙烯酰胺凝胶

    (xi)序列描述：SEQ ID NO：5

CGCGGATCCT TTAAGGAGTT CCTG                                           24

(6)SEQ ID No：6的信息

    (i)序列特征

        (A)长度：73个核苷酸

        (B)类型：核苷酸

        (C)链性：单链

        (D)拓扑性：线性

    (ii)分子类型：合成DNA

    (iii)假定：无

    (iv)反义：无

    (v)片段类型：羧基末端

    (vii)直接来源

        (A)合成：寡核苷酸合成仪

    (ix)其它特征

        (A)名称：175I/167R/183A(S)

        (C)鉴定方法：聚丙烯酰胺凝胶

    (xi)序列描述：SEQ ID NO：6

GCCTGAGATC TTTTAAGGAG TTCCTGATCC GTAGCCTGAG GGCTCTTCGG GCTATGTAGG    60

GCGGCCGCAT GGC                                                       73

(7)SEQ ID No：7的信息

    (i)序列特征

        (A)长度：73个核苷酸

        (B)类型：核苷酸

        (C)链性：单链

        (D)拓扑性：线性

    (ii)分子类型：合成DNA

    (iii)假定：无

    (iv)反义：有

    (v)片段类型：内在的

    (vii)直接来源

        (A)合成：寡核苷酸合成仪

    (ix)其它特征

        (A)名称：175I/167R/183A(AS)

        (C)鉴定方法：聚丙烯酰胺凝胶

    (xi)序列描述：SEQ ID NO：7    

GCCATGCGGC CGCCCTACAT AGCCCGAAGA GCCCTCAGGC TACGGATCAG GAACTCCTTA     60

AAAGATCTCA GGC                                                        73