蝉拟青霉新菌株APC－20及其人工培养发酵方法

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，尤其是属于利用一种蝉拟青霉新菌株APC-20，进行人工固体或液体发酵，以提高孢梗束和菌丝体的产量和质量。

背景技术

蝉花自古以来是一种药用价值很高的珍贵中药材，它是由蝉拟青霉(Paecilomyces cicadae)寄生于蝉类若虫的复合体。以往人们主要采集稀有的天然蝉花用于各种保健品或作为配伍用药材。但天然蝉花已越来越少，且产量低，一年只能采收一次，同时产品质量受环境影响而参差不齐。自然界现有的蝉拟青霉菌存在有长势、产量、质量不一的问题，不能适应工业化生产的需要；有文章报导认为，把天然菌种用来进行人工固体培养发酵一般长不出子实体(孢梗束)；而用来液体发酵时存在有工艺不配套，菌丝体产量低，品质不匀等问题。这既不能满足中医临床用药对孢梗束的大量需求，也制约了对蝉拟青霉菌代谢产物的产业化深加工开发利用。

发明内容

本发明针对上述不足，提出以下发明目的，一是从自然界分离选育生活力强、代谢活性物质产量高的蝉拟青霉新菌株；二是研究提出利用该蝉拟青霉新菌株进行产业化固体培养和/或液体培养，生产高产、优质的孢梗束或菌丝体及其发酵混合物的制备方法。

本发明目的是通过下述方案得以实现的。菌株的分离、选育、鉴定与保藏：

从浙江温州不同立地条件、不同生态环境采集标本，从中选择子实体大，孢梗束粗壮，无污染菌者进行分离纯化，分别予以编号，并进一步通过单孢分离方法，建立了25株菌株保存。其中从022009号起始菌中，分离选育到单孢优株APC一20菌株，经固体培养基发酵菌丝生长势，液体培养基菌丝体干重及多糖含量三个指标的测试表现最好，该菌株经中国科学院微生物研究所复核鉴定为蝉拟青霉(Paecilomyces cicadae)，并通过卫生部菌株安全性毒理试验为无毒安全菌株，该菌种在40％含水量的无菌土在4℃冰箱中保存544天未见失活.

本发明的蝉拟青霉APC-20菌株已于2004年03月03日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO：1104.本发明的蝉拟青霉APC-20菌株(CGMCC NO：1104)具有以下微生物学特性：

1、形态特征：

(1)、蝉花  寄生后的虫尸僵化，略呈弓状，表面裹覆白或浅黄色的菌被，仅见附肢。解剖虫体，体腔内充满白色菌丝体，并交织成革状物。虫尸大小约30-45×10-18mm，离表土2-8cm左右。在温湿度合适的生长季节，前端长出柱状孢梗束，并伸向地面。孢梗束橙黄色，单生或成丛，30-50×2-5mm，顶尖或反复分枝成花菜状的头，并产生大量粉状分生孢子。子实体的地下部分容易腐烂，一般保存时间3-10天。地上部分显得更短，如遇高温干旱天气，仅几个小时就开始萎蔫。

(2)、菌株形态特征在PDA培养基上，菌丝灰白到浅黄，茸毛状。分生孢子梗分枝，78-203×2.9-50mm，通常2-5个瓶梗簇生于短枝上，成轮状排列.瓶梗基部近球形膨大，4.2-7(-13.5)×2.3-3.5(-5.2)mm，梗颈细长，向基式产生分生孢子链.分生孢子圆柱状或长卵形，无色单孢，壁光滑，3.5-9×1.5-3.7mm，少数弯曲。

2、培养特征：

在PSA培养基上生长快，24℃温育14天，直径60-72mm。菌丝体灰白或浅黄，茸毛状。有时表面出现轮纹或放射线。产孢后，菌落外貌显粉质状，背面无色，渗出液无色，水珠样。

在Czapek培养基上生长慢而局限，14天直径为49-55mm。菌落平展，菌苔薄，灰白，茸毛状密致，背面无色，未见渗出液产生。

在蛋白胨蔗糖琼脂上生长好，14天直径54-70mm。菌落表面有隆起环线，边缘有放射状沟纹，肉色，背面深褐色，未见渗出液。

在麦粒或麸皮+玉米+谷糠等自然培养基上，菌丝体茸毛状至絮状，灰白至浅黄。15天形成菌核，并产生孢梗束。孢梗束掌状或圆柱状，橙黄色或蛋黄色，20-30×3-5mm，长的可达80cm。一般30天后产生大量分生孢子，嗣后孢梗束逐渐枯萎倒伏。

3、碳，氮源利用：

(1)碳源利用测定了葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、甘露醇、菊糖、山梨糖、鼠李糖、乳糖、甘油等10种C源，除菊糖、山梨糖、鼠李糖、乳糖不能利用外，其余均能利用。但用葡萄糖作C源，孢子产量极显著高于其它C源(t＞t_0.01)，用果糖作C源，菌丝体产量显著高于其它C源(t＞t_0.05)。

(2)氮源利用测定了KNO₃、NaNO₃、(NH₄)₂SO₄、(NH₄)₂HPO₄、NH₄NO₃、(NH₂)₂CO、NH₄CL、NaNO₂、H₂NCSNH₂含硝基、氨基、亚硝基等9种N源，以KNO₃利用为好。但不能利用NaNO₂和硫脲，对硝基氮的利用有比氨基氮好的趋势。

该菌对蔗糖、葡萄糖以及N源中的KNO₃利用尽好，但对C源量的要求较敏感。当C源量维持在2％的正常生长发育水平上，提高N源或降低N源，对孢梗束生长和产孢量影响不大；但N源固定在正常生长水平上，将C源从2％降低到0.5％，发现不产生孢梗束或仅极少孢梗束。反之，将C源提高10陪(20％)，则孢梗束多而不易老化，分生孢子有推迟产生现象。

4、人工培养品多糖含量测定：

天然蝉花多糖含量为4.40％，液体培养品多糖含量为11.4％，固体培养品多糖含量为12.8％。

此外，将APC-20菌株与亲株22009(对照)经固体培养与液体培养试验，在长势、孢梗束产量，菌丝体干重等方面存在较大区别：

表1固体培养基上生长状况

表2液体培养基上菌丝体干重

注：摇床培养转速110r/min，马铃薯-蔗糖培养液，培养10天

菌丝体干重测定   取发酵液100ml用100目纱滤网过滤，每次取样3次重复，取其中的滤渣菌丝体于CT-C-O型热风循环烘箱内70℃烘干至恒重，换算成每100毫升发酵液中菌丝的干重。

使用本发明的菌株进行以下人工固体发酵和/或液体深层发酵的方法，包括在含有碳源、氮源，无机物和其它营养物的培养基中培养蝉拟青霉APC-20菌株的步骤、工艺，直至在固体培养基的表层，形成子实体(孢梗束)，在其内层也同时形成了大量的菌丝体及其有效代谢产物；在液体培养基中形成菌丝体的同时，也积累了菌丝体的有效代谢产物，与培养基一起成为具有进一步开发价值的发酵混合物。

A、固体培养发酵方法：

1、培养条件

(1)菌种制备：

①、斜面菌种的制备4℃冰箱内保存的APC-20菌株移植到PSA培养基上培养7天，活化待用。

②、一、二级种子的制备一级种子的制备：每支摇瓶(500ml三角瓶装200ml种子培养基)移接入斜面菌种上的分生孢子粉3环，置DHZ-C振荡器内25℃，120r/min转速下培养4天。二级种子的制备：10L发酵罐中装7.5L(以75％容积计算，下同)二级种子培养基，121℃灭菌30min后冷却至24℃，接入一级种子，接种量10％(下同)，控制发酵条件(24℃，罐压约0.01-0.05Mpa，空气流量约0.75m³/h)，发酵48h。

(2)培养基：

斜面培养基：采用PSA或Richard培养基；

一级种子培养基：PSA固体培养基(马铃薯200g、蔗糖20g、琼脂20g、水1000ml)或Richard培养基(KNO₃ 10.0g、KH₂PO₄ 5.0g、MSO₄.7H₂O 2.5g、FeCl₃ 0.02g、蔗糖50.0g、水1000ml)；

二级种子培养基：PSA液体培养基(马铃薯200g、蔗糖20g、水1000ml)；固态发酵用培养基：纯麦粒或麸皮(2-4)∶玉米(1-3)∶谷糠(1-3)的重量比配制，优选配方是麸皮2∶玉米1∶谷糠1并加2％果糖；

(3)接种量封闭式培养，接种量用1％-5％，优选为3％；开放式培养，接种量为5％-20％，优选为10％；

(4)培养时间斜面种培养时间以5-7天为宜。1-2级种子采用液体摇床或种子罐培养，龄期2-3天为好，接种后生长旺。固体培养时间20-30天，

一般35天后孢梗束开始老化倒伏，菌丝产生自溶现象。

(5)培养温度斜面种以及种子培养阶段，温度最适24-25℃。固体发酵的菌丝体生长阶段温度以24-25℃为宜，孢梗束始发期温度应控制在20-22℃。

(6)pH pH6.5左右.该菌要求偏酸性，在碱性条件下，菌丝容易老化色变.

(7)光灯光、自然光均能刺激孢梗束生长，暗培养不产生孢梗束，或孢梗束量少，柔弱、色变。

(8)培养室和培养器封闭式培养容器可用蘑菇瓶(500mL)或塑料制品ZP4瓶(500ml)或聚丙烯塑料袋来培养。开放培养容器可用金属或陶瓷浅盘，但高度要求在6cm左右。开放式培养室要求有温湿调控以及通气(无菌过滤)、光照等设备，并便于消毒灭菌，洁净度达到100级。

2、培养方法和步骤

A、固体培养

用斜面种接种一级种子，500ml三角瓶摇床培养(72h，110-120r/min)；二级种子采用10L种子罐制备(24℃，罐压0.04-0.05Mpa，空气流量约0.75m³/h培养36h)；采用70L种子罐制备(24℃罐压约0.05Mpa，空气流量1.3-1.6m³/h)培养36h，就可用来接种.接种量为1-5％然后置室内培养，前期培养温度可控制24-25℃，孢梗束始发后应控制在20-22℃，培养20-30天，可采收。

用曲盘作开放式培养时，灭菌后培养料厚度可控制在1.5-3.0cm左右，接种量为5-20％。接种后料面盖二层灭菌的湿纱布，纱布上再覆一层灭菌过的聚丙烯薄膜。整个培养过程要注意保湿并保持清洁。孢梗束生长始期后可揭开纱布与聚丙烯薄膜(接种后一周)，20-25天始采收，采收后孢梗束晒干或80℃烘干。

B、液体培养发酵方法

1、培养条件：

(1)菌种种子制备：制法同固体培养；

(2)培养基：

斜面母种培养基：PSA或PDA培养基：马铃薯200g、蔗糖20g、琼脂20g、水1000ml PH自然；

一级种子培养基：PSA培养液体培养基：马铃薯200g、蔗糖20g、水1000ml；

二级种子培养基：PSA培养液：马铃薯200g、蔗糖20g、水1000ml；

生产发酵培养基：马铃薯20％，果糖2％，蛋白胨0.1％，天冬氨酸0.01％，KH₂PO₄0.15％，MgSO₄0.05％，植物油0.1-0.15％、水77.54-77.59％；

(3)接种量  一级种子或二级种子接入二级培养基或生产发酵液的接种量为10％；

(4)  发酵温度  温度的变化对菌丝体的生长影响极明显，23-26℃条件下均可生长，优选是24-25℃，最佳为24℃，菌丝体生长最快，干重量高(见表3)；

表3发酵温度对蝉拟青霉菌丝生长的影响

(4)PH值APC-20菌株在PH 4-12均能正常生长发育，优选PH为6.5，该范围菌丝体干重产量最高；也可采用自然PH值，便于生产操作；

(5)发酵时间  以菌丝得率为指标，放罐时间选择在84h左右。

2、培养方法与步骤：

采用70L发酵罐装52.5L发酵培养液，其中添加消泡剂植物油0.1-0.15％，121℃灭菌30min后冷却至24℃接入培养好的二级种子，控制发酵条件(罐压约0.05Mpa，空气流量约1.3-1.6m³/h，温度24℃左右)，发酵84小时后放罐。

C、将以上固体培养物孢梗束和液体培养物菌丝体与天然蝉花主要成份作如下比较分析：

1、糖醇类成份比较经硅胶GTLC层析，以异丙醇∶乙酸乙酯∶水(83∶11∶6)为展开剂，0.5％高锰酸钾及0.5％联苯胺醇液为显色剂，二者出现的蓝底黄斑点与甘露醇的Rf值一致。

2、有机酸类成份比较  经纸层层析，以正丁醇∶冰醋酸∶水(3∶1∶1)为展开剂，溴甲酚绿为显色剂，培养物出现蓝底黄点比天然产物多3个斑点。若以正丁醇∶乙醇∶氨水∶水(4∶1∶2∶2)为展开剂，溴酚蓝为显色剂，两者出现的斑点、Rf值一致。

3、生物碱类比较经硅胶GTLC层析，以氯仿∶甲醇(9∶1)为展开剂，出现橙红色斑点较天然产物少1个。若以正丁醇∶乙醇∶水∶氨(4∶1∶2∶2)为展开剂，两者出现的斑点和Rf值一致。

4、甾醇类成份比较  经硅胶GTLC层，以茴香醛醋酸硫酸液显色后置110℃加热10分钟，两者显示色斑不少于10个，其斑点颜色及Rf值均基本一致。

此外，两者都含有15种相同水解氨基酸和12种微量元素。由此可见，蝉拟青霉人工培养物和天然蝉花化学成份基本相同，均含有脂肪类、蛋白质、氨基酸、甾醇类、有机酸和生物碱等有效成份。

本发明的有益效果，一是选育获得了生长势强，人工发酵培养物(孢梗束，菌丝体)产量高，品质好的蝉拟青霉APC-20新菌株；二是本发明提出了应用APC-20菌株进行人工培养固体发酵生产子实体(孢梗束)的优化工艺及配套方法，从而实现了人工，周年，大批量生产品质优良(最高单株孢梗束干重达9.77克，平均长度达18.92mm)质量一致的传统名贵真菌中药蝉花的目标；三是本发明提出了应用该菌株进行人工培养液体发酵生产菌丝体及其代谢产物混合液的优化工艺及配套方法，使菌丝体干重产量由亲菌株的1.51g/200ml提高到APC-20菌株的2.76mg/200ml，最高的达到3.03mg/200ml，而且液体发酵还具有生产周期短(3-5天)，质量便于控制(工业化标准生产)，操作方便等优点；四是应用本发明的菌株和配套方法生产的人工发酵培养物与天然蝉花的主要成份进行了比较分析，所含糖醇类、有机酸类、生物碱类及甾醇类均基本一致，此外，两者都含有15种相同水解氨基酸和12种微量元素；因此，本发明提供了孢梗束及发酵培养混合物的高产、优质配套技术，为它们所含有效活性代谢化合物的进一步深度开发利用打下基础。