制造具有生物受体协同剂、拮抗剂与/或反向协同剂的人类抗体方法

具体实施方式

除非另有指明，本发明所使用的名词定义如下：

配体是指结合至另一分子的化合物，例如受体蛋白；

受体是指与细胞外生理讯号作用并转换为细胞内部效应的蛋白；

完全人类抗体是指一抗体仅含有人类序列；

静息()人类捐赠者是指未暴露于所欲抗原的人，其血液可作为免疫细胞或因子的来源，静息捐赠者血液测不到抗原的循环抗体，典型的静息人类捐赠者为健康正常的捐血人，其HIY抗体侦测为持续阴性；以抗原免疫细胞或动物是指将细胞或动物暴露于抗原的动作，细胞或动物可以任何方式进行免疫，只要细胞或动物接触到抗原即可。

体外定位免疫是指体外淋巴细胞刺激过程，以达到对所欲蛋白片段的抗体反应，依据合成的异质偶合决定部位免疫原，其含有T细胞与B细胞抗原决定部位的胜肽，可引发体液免疫反应以对抗整个蛋白；

治疗或改善疾病或医疗状况是指减少或消除疾病或医学上的症状，或缓和疾病/医疗状况的进程；

预防疾病或医学症状是指检测一不具疾病或医学症状的受测者，其中，最后受测者未发展成带有该疾病/医学状况，或者疾病/医疗状况仅些许发展。

有效量是指一药剂的量足以达到所欲效用，以抗体的治疗或改善一疾病而言，一有效量意谓足以降低或消除疾病症状或缓和疾病进程的抗体量；

协同剂是一配体具有与另一天然发生的内生性配体或配体族群相同或相似效用者的；

拮抗剂是一配体或药物的作用阻断一协同剂者；

反向协同剂是指一配体，其产生的效用相反于协同剂却可占用相同的受体；

受体阻断是指利用药理拮抗剂结合至受体来阻断天然内生性配体(如荷尔蒙或神经传导因子)结合至受体后所发生的效用。

样本是指分装物或物质、材料或族群的代表部分，一样本可为水、污物、油、砂、血液、生物组织、尿液或粪便的样本；

生物样本是指由生物性受测者如动物、植物或微生物所收集到的样本。

本发明亦包括药物组成物，包含可作为活性成份的一或多种抗体，并配合药学上可接受载体或佐剂。在制备本发明组成物方面，活性成分/抗体通常与佐剂混合、以佐剂稀释或以载体包封，其型式可制成胶囊、小袋、纸样或其它容器。

当药学上可接受的佐剂为一稀释剂时，可为固体、半固体或液体材料，并作为活性成分的溶媒、载体或媒介。因此，本组成物可为溶液(尤指无菌的可注射溶液)、药片、药丸、粉末、锭剂、小袋、胶囊、酏剂、悬液、乳液、糖浆、气雾剂(如固体或液体媒介)、含有如10％重量百分比抗体的药膏、软或硬凝胶胶囊、栓剂及无菌包装粉末等形式。

适用佐剂的某些范例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻多醣、黄着胶粉、凝胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、无菌水、糖浆、甲基纤维素。本组成可还包括：润滑剂例如滑石粉、硬脂酸镁及矿物油；保湿剂；乳化剂及悬浮剂；防腐剂如甲基-与丙基羟苯酸酯；甘味剂；以及调味剂。本发明组成物可配置为供应病患投药后的快速、缓慢或延迟释放其活性成分，其方式如公知技术中所示。

本发明新组成物的液体形式可配置成口服或注射给药，包括水溶液(例如PBS)、适当调味糖浆、水性或油性悬液，及经调味的乳液，其含有可食用油如玉米油、棉籽油、芝麻油、椰子油、或花生油，以及酏剂与类似的药学上溶媒。本发明的其它适用配，方可见于雷氏药学大全(Remington’s Pharmaceutical Science)。

下列范例只是用来对本发明作说明，非做为局限本发明范畴。例如，类似的研究亦针对其它CD28受体超家族成员及其如CD28异型(CD28i)、可诱发的共激蛋白(ICOS)、B与T淋巴细胞衰减蛋白(BTLA)及程序细胞死亡蛋白-1(PD-1)。同样地，亦可应用于其它受体家族，包括离子通道、G-蛋白偶合受体、酪氨酸激酶连接受体及转录因子等。

表一：

实施例一、胜肽抗原的制备

人类CD152受体的整体结构绘于图1A。符合于人类CD152的氨基酸序列则列于图1B。由整合科学文献所得的资讯，CDR3区与天然CD80及CD86配体之间的重要关联性因而建立。另外的证据显示，位于CDR1区的氨基酸扮演某种与CD80/CD86作用的角色。然而，CDR2的协同剂结合机制至今却尚未被完整探讨。

想要引发可结合至本体蛋白的抗体，所使用蛋白的胜肽必须具有类似其构造的特性。因此，CDR1、CDR2与CDR3区的完整序列被保留下来以设计合成的免疫原。此外，延长每个CDR胜肽部分以符合前述抗原决定部位模式。作为一有效免疫原，若欲实际使用所产生的抗体，则此胜肽必须选自蛋白的易构区(accessible region)。蛋白的易构区为暴露于结构外侧的部位。由于这些区域与水溶液环境接触，故经常为亲水性。而后人们使用GeneWork^软件(IntelliGenetics)建立疏水性绘图以决定延长方向。链变动性或表面可能性亦以GeneWork^计算，而CDR附近区域亦视为胜肽设计的二级参数(图2)。

经运算后所得的高分CDR胜肽用于连接破伤风毒素“辅助”序列，其氨基酸位置为830-844(SEQ ID NO：1)。

实施例二、抗CD152人类抗体的产生

健康血液捐赠者经HIV-1/2、HTLV-I/II、HCV、HbsAg筛选为阴性，并含有正常量的丙胺酸转移酶(ALT)的血液，来自中华血液基金会台南捐血中心(台南，台湾)。周边血单核细胞(PBMC)以密度离心(400xg)方式分离于Ficoll-Paque(Amersham Biosiences)；细胞随后以PBS洗涤两次并以100xg离心收集。

所得PBMC首先以CD45RO MACS微珠(Miltenyi Biotec)进行磁标定，再以VarioMACS(Miltenyi Biotec)进行分离。在磁标定后，将细胞通过分离管柱，其置于强力永久磁铁上。通磁管柱的基质可产生高阶磁场。磁标定细胞会停留于管柱内并滤出未标定细胞。在管柱磁场解除后，冲提出细胞。冲提出的CD45RO⁺细胞以100xg离心取得并立即使用。将CD45RO⁺T-细胞培养于组织培养瓶中，其密度为2×10⁶细胞/mL RPMI-1640(HyQ^TM，HyClone)，并补充1x非必需氨基酸(Life Technologies)、10％人类血清、50μm/ml庆大霉素/卡那霉素(China Chemical &Pharmaceutical)、50μM 2-乙基硫醇及10μg/ml美洲商陆分裂促进剂(PWM，Sigma)。培养24小时后，细胞以400xg离心并移出。最后，收集上清液以制备CD45RO⁺T-细胞替代因子，以0.45mm滤膜过滤并于-20℃冷冻储存。

将PBMC以磁性细胞去除法去除细胞毒性族群，以体外抑制免疫反应。胶体超磁性微珠结合至单株抗小鼠CD8与抗CD56抗体(MiltenyiBiotech)的用法如前述。细胞毒性细胞去除的PBMC于体外以二步骤免疫法进行免疫作用：初级免疫作用，是将细胞培养于含10nM胜肽抗原的培养基6天，亦即TT-CDR1_(ext)、TT-CDR2_(extC)与TT-CDR3_(ext)于含50μM2-乙基硫醇、10％热去活化人类血清、0.05ng/mlrIL2(Calbiochem)及25％(v/v)CD45RO⁺T细胞替代因子，在第7天收取初级免疫细胞并以40％Ficoll-Paque离心；针对次级免疫反应，将3×10⁷个细胞与胜肽抗原混合于事先以5μg/ml的CD40L(CD154，Vinci-Biochem)固定隔夜的培养瓶；再以含有5％人类血清、50μM 2-乙基硫醇及10nM胜肽抗原的培养基培养细胞3-5天。

体外免疫的细胞随后以EB病毒感染：将10⁷个淋巴细胞于37℃下培养2小时，以1ml含EB病毒的上清液进行再悬浮，此上清液源自产生EB病毒的狨猴细胞株B95-8(ATCC CRL 1612)。将感染的细胞以10⁵/孔的数量种于96孔盘并加入丝裂霉素(Kyowa Hakko Kogyo)处理的PBMC以作为喂养细胞(10⁴/孔)。

抗体专一性ELISA的进行，首先于室温下以1μg/ml BHK细胞表现的重组人类CD152(CTLA-4)-muIg融合蛋白(Ancell Corporation)、1μg/ml单株鼠类IgG2a(Ancell)、10μg/孔的牛血清白蛋白(BSA，Sigma)或破伤风类毒素(ADImmune Corporation)隔夜涂覆于微量滴定盘。将培养的上清液以含0.5M气化钠及0.1％Tween-20的10mM磷酸钠缓冲液，pH8.0稀释至所欲浓度。涂覆的滴定盘以稀释的培养基上清液进行培养，洗涤后以过氧化酶标定的山羊抗体辨识人类IgG(Zymed Laboratories)，并加入100μl色原基质邻-苯二胺(OPD，Sigma)显影15min；30in后加入1M硫酸停止反应，于490nm吸光值下判读结果。

以上述固态ELISA确认EB病毒感染的淋巴细胞所释出可能的抗-CD152抗体。每孔所含淋巴细胞的专一性抗体生成量的积分，是以下列标准进行：(a)重组人类CD152-muIg融合蛋白的OD值至少为阴性对照组OD值的五倍；以及(b)反应性指数(R1)＞2，其中RI＝[OD_CD152-muIg-OD_{培养基控制组对CD152-muIg}]/[OD_鼠类IgG2a-OD_{培养基控制组对鼠类IgG2a}]。

含淋巴细胞的孔若于上述分析中呈阳性，则收集其上清液，并以ELISA定量及标准化以进一步研究。CDR区反应性的确认是利用个别胜肽进行ELISA竞争反应。这些培养孔以限数稀释法转殖并冷冻保存。

实施例三、改变抗CD152抗体的能力以诱发细胞凋亡及细胞分化并与天然协同剂相比较

不同抗-CD152人类抗体结合位置的确认是将合成的胜肽相应于一级烷基胺衍生的纤维素膜(Rapp Polymere GmbH)。为进一步评估不同抗-CD152抗体与较佳的天然协同剂CD80的药理学效用，进行人类周边淋巴细胞体外植物血凝素刺激后的细胞生长及PBMC培养。简单而言，准备平底的96孔微量滴定盘并加入50μl山细胞悬浮液(10⁵个细胞)、60μl含PHA培养基(培养的最终浓度为1.25μg/ml，Amersham BiosciencesAB)、40μl自体血浆及50μl RPMI-1640培养基，其含抗-CD152抗体或单体的人类CD80-muIg融合蛋白(Ancell)浓度范围由0.2至5μg/ml。在CD80刺激反应中，加入5μg/ml山羊抗小鼠IgG2a(SouthernBiotechnology Assocetes)以提供交联形式的讯号。培养的总体积为200μl。培养于37℃的5％CO₂潮湿环境中达96h。在收集前204小时，每孔加入50μl含0.5μCi的氚化胸腺嘧啶的培养基(TRA 306，Amersham，特定活性2Ci/mol)。以玻璃纤维滤膜配合半自动多重收集器(PHD，Cambridge Technology Inc.)收集培养基。细胞结合[³H]-胸腺嘧啶的决定是以LKB液体闪烁计数仪进行计数。在有些培养中，末期以锥虫蓝(Trypanblue)染剂进行细胞存活率的测量。进行相同的三重复培养，并以三者的中间值进行运算。

评估细胞调亡百分比，是将细胞以200xg离心，再悬浮于冰冷的80％酒精并且剧烈震荡混合直到最终密度1×10⁶/ml。将细胞培养于4℃至少30min。酒精固定的细胞随后离心并于1ml碘化丙啶(PI，Sigma)染剂(PBS0.15M pH7.4、0.1％Triton X-100、0.1mM EDTA二钠盐、50μg/ml RNase A及50μg/ml PI)中进行再悬浮。样本于室温下黑暗保存直到分析，并于24小时内进行。细胞核内的DNA量以碘化丙啶染色及FACScan细胞仪配合Lysis H software(Becton Dicknson)决定。凋亡细胞的决定是利用流式细胞仪测量碘化丙啶染色后的次双套DNA百分比。

提供一盘抗-CD152的人类抗体，以决定这些配体在PHA活化下对人类T细胞的功用，可产生中度细胞分化与细胞凋亡(图3A)。交联的CD80所诱发的细胞凋亡并未观察到有明显细胞分化(图3B)。类似地，含CDR3的胜肽免疫原所诱发的抗体亦引发快速的细胞死亡而非分化，因而确认了协同剂活性(图3E)。CDR1诱发的人类抗体的刺激作用明显降低，但未完全去除PHA驱动的细胞死亡(图3C)。当PHA活化的PBMC单独与CDR2诱发人类抗体培养时，可观察到高度且具再现性的细胞分化情形，且PHA造成的细胞死亡可完全去除(图3D)。由抗-CDR2诱发的细胞分化所造成CD152的驱动情形类似于5ng/ml IL-2处理情形，并造成典型凋亡细胞型态变化现象的消失(如，细胞膜泡沫化与细胞不完整及核形成小泡)。

上述实施例仅是为了方便说明而举例而已，本发明所主张的权利范围自应以申请专利范围所述为准，而非仅限于上述实施例。

                          序列表

<110>Chin，Li-Te

     Hsu，Shu-Ching

<120>具有协同剂、拮抗剂或反向协同剂特性的人类抗体制造方法

<130>P7226/0600

<160>8

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>15

<212>PRT

<213>破伤风毒素

<220>

<221>胜肽

<222>(1)..(15)

<300>

<301>Stephane Demotz，Antonio Lanzavecchia，Ulrich Eisel，Heiner

    Niemann，Christian Widmann，and Giampietro Corradin

<302>描述多种DR-限制的T细胞抗原决定部位

<306>394-402

<307>1989-01-15

<313>(1)..(15)

<400>1

Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu

1               5                   10                  15

<210>2

<211>15

<212>PRT

<213>现代人

<220>

<221>胜肽

<222>(1)..(15)

<400>2

Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val

1               5                   10                  15

<210>3

<211>15

<212>PRT

<213>现代人

<220>

<221>胜肽

<222>(1)..(15)

<400>3

Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp

1               5                   10                  15

<210>4

<211>15

<212>PRT

<213>现代人

<220>

<221>胜肽

<222>(1)..(15)

<400>4

Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly

1               5                   10                  15

<210>5

<211>30

<212>PRT

<213>人工合成

<220>

<223>合成CDR胜肽并用于制备相合的抗原决定部位以连接源自破伤风病毒“TT”序列。

<220>

<221>胜肽

<222>(1)..(30)

<400>5

Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Glu

1               5                   10                  15

Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val

            20                   25                 30

<210>6

<211>30

<212>PRT

<213>人工合成

<220>

<223>合成CDR胜肽并用于制备相合的抗原决定部位以连接源自破伤风病毒“TT”序列。

<220>

<221>胜肽

<222>(1)..(30)

<400>6

Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Ala

1               5                   10                  15

Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp

            20                  25                  30

<210>7

<211>30

<212>PRT

<213>人工合成

<220>

<223>合成CDR胜肽并用于制备相合的抗原决定部位以连接源自破伤风病毒“TT”序列。

<220>

<221>胜肽

<222>(1)..(30)

<400>7

Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys

1               5                   10                  15

Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly

            20                  25                  30

<210>8

<211>223

<212>PRT

<213>现代人

<220>

<221>胜肽

<222>(1)..(223)

<300>

<308>P16410

<309>2004-03-15

<313>(1)..(223)

<400>8

Met Ala Cys Leu Gly Phe Gln Arg His Lys Ala Gln Leu Asn Leu Ala

1               5                   10                  15

Thr Arg Thr Trp Pro Cys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Pro

            20                  25                  30

Val Phe Cys Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala

        35                  40                  45

Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly

    50                  55                  60

Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln

65                  70                  75                  80

Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr

                85                  90                  95

Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val

            100                 105                 110

Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile

        115                 120                 125

Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly

    130                 135                 140

Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser

145                 150                 155                 160

Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe

                165                 170                 175

Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys

            180                 185                 190

Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu

        195                 200                 205

Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn

    210                 215                 220