法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2013-10-30
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12N15/09 授权公告日:20081008 终止日期:20120901 申请日:20050901
专利权的终止
2008-10-08
授权
授权
2006-06-28
实质审查的生效
实质审查的生效
2006-05-03
公开
公开
技术领域
本发明涉及的是一种生物技术领域的方法，特别是一种原子力显微镜诱导单分子DNA定位突变的方法。
背景技术
原子力显微镜(Atomic Force Microscopy，AFM)也称扫描力显微镜，是IBM苏黎世实验室的Binnig和斯坦福大学的Quate教授于1986年发明的。AFM的工作原理类似于一个老式的唱针式留声机，它用一个微小的探针以纳米级的分辨率对局域表面进行扫描，以微探针与样品表面之间的力学相互作用表征表面的形貌及力学信息。如果适当控制探针对表面施加的力，就可以对样品的局域表面进行精确可控的实时探测、修饰和改造。AFM对样品的适用性广，可以对各种样品进行成像和操纵，包括对生物样品如DNA的成像和操纵。
在对DNA的操纵研究中，M.Rief等在《Nature Structural Biology》1999，6(4)：346-349上发表的“Sequence-dependent mechanics of single DNAmolecules”(自然杂志结构生物学分册，“单分子DNA序列依赖的力学性性质”)一文中提出：当用AFM对DNA分子作拉伸操纵时，如果AFM针尖施加的力大于65pN，则DNA分子的二级结构可以由通常的B型结构变为过度拉伸的S型结构，外力撤消后，不能回复为B型结构。H.Hansma等人用AFM对固定在衬底表面上的DNA分子做径向切割，发现AFM针尖施加的机械力可以造成DNA的损伤，甚至DNA链的断裂。这些研究表明对DNA分子的微区施加的机械力作用可能导致局部DNA分子本身或配对行为的变化。
DNA分子上的基因突变是指由于DNA碱基对的置换、增添或缺失而引起的基因结构的变化。目前的人工基因突变技术包括随机突变和定点突变。相比随机突变技术，定点突变技术可以精确地控制突变位点，通过设计特定的引物引入突变点，然后进行聚合酶链式扩增反应(PCR反应)从而获得突变后的基因。这一方法在功能基因组学、基因治疗、药物靶筛选、细胞信号传导通路分析、蛋白质相互作用等研究方面有广泛的应用，但一段DNA序列中多点定点突变是个难点。H.Hogrefe等发表在《Biotechniques》(《生物技术》)杂志，2002，33(5)：1158-1165的“Creating randomized amino acid libraries with the QuikChange MultiSite-Directed Mutagenesis Kit”的文章中，采用QuickChangTM试剂盒点突变方法对DNA进行多点诱变，提到随定点突变点数目增多突变成功的效率大大下降。特别需要指出的是，不论在随机突变还是定点突变领域，目前还仍然建立在具有统计意义的多分子体系基础上，都不能在单分子水平上对单个DNA分子进行诱变，而且均无通过机械力诱导的基因突变的报道。由于AFM的精确定位功能，在单分子水平上对单个或多个位点进行机械力定位诱导突变具有实际意义，而且在原理上是可行的。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种原子力显微镜诱导单分子DNA定位突变方法，使其具有高分辨率，精确定位，节约用时，操作简便，易于实行的优点。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明通过AFM针尖对单个DNA样品的操纵而实现，附以单分子拾取、单分子PCR扩增以及常规测序方法，最终得到定位突变后的样品。本发明方法包括以下步骤：
(1)制备氨基硅烷修饰的云母衬底；
(2)DNA样品的末端标记；
(3)标记后DNA样品的拉直制备；
(4)AFM对DNA进行诱导突变；
(5)AFM对诱导后DNA片段的拾取分离；
(6)分离后的DNA片段的单分子扩增；
(7)琼脂糖凝胶电泳检测扩增情况；
(8)扩增样品的DNA序列测定，筛选出突变样品。
所述的步骤(1)中，用体积浓度为1％的3-氨基-丙基-三乙氧基硅烷(APTES)修饰衬底。
所述的步骤(2)，是指：用已知序列的DNA做模板，用单端由生物素标记的寡核酸作引物，进行聚合酶链式反应(PCR)扩增得到生物素单端标记的DNA分子，然后再和抗生物素蛋白亲和素作用(亲和素与DNA的摩尔比例为2∶1)，就得到亲和素单端标记的DNA分子，由于亲和素体积较大，与DNA分子可明显区别，因此可以由AFM识别，从而确认DNA分子的标记端。
所述的步骤(3)，DNA样品的拉直适用所有的DNA样品。有三种方法可以将DNA样品拉直在APTES修饰的表面上：(1)将标记好的DNA样品滴于APTES修饰后的云母上，采用离心法将DNA样品液滴甩出，依靠离心力将DNA分子拉直于APTES表面上；(2)将标记好的DNA样品滴于APTES修饰后的云母上，然后用洁净的盖玻片一侧接触云母片，沿一个方向落下盖在云母上，靠液流的引力将DNA分子拉直于APTES表面上；(3)将标记好的DNA样品滴于APTES修饰后的云母上，采用洁净的盖玻片一侧沿一定角度从云母上刮过，靠液流的引力将DNA分子拉直于APTES表面上。
所述的步骤(4)，是整个方法中的关键步骤，具体操作为：
1)由AFM对拉直的DNA样品大范围扫描，找到标记的DNA分子；
2)由标记作识别位点，对DNA上要诱变的靶序列进行定位；
3)缩小扫描范围到适合尺寸；
4)打开抬高模式，调整参数设置，通过测量DNA上距标记点的长度确定要突变的点位置，精确到5nm以内，在该点处对DNA分子作单线扫描，降低针尖高度，加大扫描时针尖对DNA分子施加的机械力，但要小于将DNA切断时所用的力，对DNA分子进行诱变。
5)诱导结束后，减小施加力的作用，返回成像模式。
所述的步骤(5)，是指：在AFM针尖对DNA分子诱导突变后，由AFM针尖将诱导区域的DNA片段分离拾取。先由针尖将要分离的片段两端切断，然后用“揉”的方法，将DNA分子折叠成一个颗粒，然后由AFM针尖拾取。
所述的步骤(6)，分离片段的扩增采用单分子PCR扩增，PCR反应体系参见各种商业聚合酶说明书。单分子扩增程序与常规PCR程序不同，扩增条件为：首先95℃预热2分钟；然后50个循环，分三步：
1)借鉴booster PCR与热启动程序，提高退火温度10℃，提高特异性，退火时间增加到3分钟，使引物有足够时间与模板配对，10个循环，每个循环包括：94℃变性30秒，65℃退火3分钟，72℃延伸45秒；
2)借鉴降落PCR程序，进一步放大模板信号，10循环，每个循环包括：94℃变性30秒，65℃降落至58℃退火1分钟，72℃延伸45秒；
3)常规PCR程序，增加产量，30个循环，每个循环包括：94℃变性30秒，58℃退火1分钟，72℃延伸45秒；
最后72℃延伸7分钟。
所述的步骤(7)，琼脂糖凝胶电泳包括以下步骤：
1)制备1.5％的琼脂糖凝胶(含染色剂溴乙锭)；
2)吸取不同样本的PCR产物上电泳槽点样，同时点分子量标记作为参照；
3)加以4～5V/cm的电压，电泳；
4)凝胶成像系统紫外检测分析结果。
所述的步骤(8)，扩增样品的DNA序列测定是指：对经琼脂糖凝胶电泳检测扩增为阳性的样品作常规测序(Sanger法测序)。与原序列比对测序结果，检测突变。
本发明原子力显微镜诱导单分子DNA定位突变方法中，原子力显微镜诱导突变涉及的对象包括DNA和RNA。
在本发明中，采用在微区内施加机械力的方法，利用物理因素对单个DNA分子进行定位突变，这是一种全新的物理的方法诱导的DNA突变技术，与常规的物理因素诱导DNA随机突变的方法相比较，由AFM诱导的DNA变异则可以在单分子水平上，以小于5nm的分辨率精确定位到DNA分子链上的任意一点。在原理上，该方法将能够在一段DNA上进行定位诱发多点突变。具有效果显著，操作可控，高分辨率确定位，节约用时，操作简便，易于实行的优点。将突变后的片段拾取后通过单分子PCR扩增产生大量突变后的分子，可以方便地开展后续分子生物学操作。该技术将可能作为现有定点突变技术的补充，应用于功能基因组学、基因治疗、药物靶筛选、细胞信号传导通路分析、蛋白质相互作用等领域，有着潜在而巨大的应用价值。
附图说明
图1本发明方法流程图
图2由AFM对单个DNA片段的诱导、切割、分离过程图
图3由AFM分离的单拷贝模板PCR反应的结果图
具体实施方式
结合本发明的内容提供实施例：
实施例pBR322质粒DNA上的一段序列的AFM定位机械诱导突变
如图1所示，AFM对pBR322 DNA的定位机械诱导突变及检测包括以下步骤：
1.制备氨基硅烷(APTES)修饰的云母衬底，用体积浓度为1％的3-氨基-丙基-三乙氧基硅烷(APTES)修饰衬底。具体步骤为：
1)APTES用水稀释为体积浓度为1％，并吸取20μl滴于洁净的封口膜上；
2)新解离的云母(20mm×20mm)用洗耳球吹去碎屑，反盖在APTES液滴上；
3)室温修饰5min，用重蒸水淋洗4次，置于滤纸上，用干净的氮气吹干；
4)修饰过的云母置于烘箱中在120℃烘烤2小时，然后经紫外线辐照15min；
5)置于干燥器中保存备用。
2.以pBR322质粒DNA为模板，用生物素标记的寡核苷酸为上游引物进行扩增，以获得单端标记的长为4,220bp的DNA样品。引物为：
P1：5’-biotin-ACGCTCGTCGTTTGGTATGGC-3′
P2：5′-CCGGCTGGCTGGTTTATTGC-3′
按DNA与抗生物素蛋白---亲和素的摩尔比为1∶2的比例，将扩增后的DNA与亲和素混合，于37℃温育30min，制得可由AFM针尖识别的DNA标记。
3.标记后的DNA样品拉直于APTES修饰的云母表面。拉直方法为：将标记好的DNA样品滴于APTES修饰后的云母上，采用洁净的盖玻片一侧沿一定角度从云母上刮过，靠液流的引力将DNA分子拉直于APTES表面上。
4.AFM对靶序列的机械诱导。具体步骤如下：
1)确定所要诱变的靶序列为距标记端为173bp到511bp的一个片段，
2)由AFM针尖大范围扫描找到标记的DNA分子，测量DNA分子的长度，估算每纳米的长度含有的碱基数，计算出173bp-511bp所对应的DNA的位置(距标记端70nm-210nm之间)，然后缩小扫描范围到靶序列区域，约300nm×300nm；确定要诱变的点的位置284bp，即距标记点120nm处；
3)在该点处对DNA分子作单线扫描，打开抬高模式，调整参数设置，降低针尖高度，加大扫描时针尖对DNA分子施加的机械力，控制该力大于成像所需力(0.5nN)，但小于切割所用力(10nN)，即用在0.5nN至10nN之间的力对DNA分子实施机械诱导突变作用；
4)返回成像模式，诱变结束。
5.AFM对诱变区域的拾取分离。为保证诱变区域被包括在分离的片段内，拾取的片段要大于所诱变的区域，本例中所要拾取的片段为0nm-250nm。具体操作如下：
1)按步骤3中第三条操作方式，在第250nm处作单线扫描，采用约10nN的力切断DNA；
2)用比切割稍小的力(约9.5nN)，将DNA分子揉成颗粒；
3)将DNA拾取分离。
切割与分离结果见图2，(a)为诱变前的图像，可看到线条状的拉直的单个DNA分子，其上端有一白色圆点，此为DNA分子的顶端标记物；(b)为诱变后切割的图像，显示切断很好，且被切断的部分中间并无其他断裂；(c)拾取分离后的图像，显示切割后的目标片段被针尖拾走，其余片段仍留在原处。
重复步骤3和步骤4，对不同区域的拉直好的单个DNA分子进行同样的诱导突变过程和切割拾取过程，共获取5个目标样品。
6.利用PCR技术分别对拾取的5个目标样品进行扩增，扩增用聚合酶为Takara公司的ExTaq聚合酶，引物序列为：
P1：5′-CTCTTACTGTCATGCCATCCG-3′；
P2：5′-CCGTGTCGCCCTTATTCC-3′
扩增体系为：
扩增条件为：95℃预热2分钟；50个循环，分三步：第一步10个循环，每个循环包括：94℃变性30秒，65℃退火3分钟，72℃延伸45秒；第二步10个循环，每个循环包括：94℃变性30秒，65℃降落至58℃退火1分钟，72℃延伸45秒；第三步30个循环，94℃变性30秒，58℃退火1分钟，72℃延伸45秒，最后72℃延伸7分钟。
7.对扩增后的DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测。
扩增结果如图3所示。从左至右依次为，M：分子量标记(Takara公司DL2000，分别为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；1，2，3，4，5：分离拾取样品的单分子PCR扩增体系；6，7：空白阴性对照；8：阳性对照。从图中可以看出，样品1、2、3、5有阳性结果，与阳性对照一样，产物分子量在338bp。这些结果显示AFM针尖诱导没有导致这4个单个分离的DNA片段中间产生断裂，因为如果断裂的话，PCR放大将不能进行。样品4没有条带，可能是由于拾取到的单分子在进入扩增前丢失，也有可能是这一样本的单分子扩增失败，因为单分子扩增难度较高，不能保证100％的扩增效率。空白没有条带说明没有污染。
8.对AFM机械力诱导突变的检测。经AFM诱变之后的DNA片段，在分离拾取后经PCR放大，可由常规测序方法检测诱导突变的结果。并与原模板序列进行比对，以检测诱变的效果。序列测定(显示序列自距标记端259bp至308bp)结果如下表：
如上表黑体显示，样品1，3，5在距标记端284bp的位置出现了一个转换突变(由C变为T)，该位点位于诱变区(173bp-511bp)起始处173bp后的第112个碱基处，并非出现在扩增的末端序列，可以排除由于测序方法干扰引起。样品2在该位点的序列与原模板序列相同为C。诱变效率大于50％，可见实施AFM在单分子水平上对DNA分子的诱导突变是定位的和高效的。
机译： 分离的多核苷酸，重组dna构建体，载体，转化宿主细胞的过程，诱导单倍体的玉米植物的过程，诱导单倍体的玉米植物的过程，诱导单倍体玉米的植物系的过程，突变单倍体的鉴定方法诱导植物，确定多核苷酸存在与否的方法，突变单倍体诱导植物，重组DNA的用途，玉米中单倍体诱导的遗传标记，鉴定玉米单倍体诱导剂的过程以及遗传标记的使用
机译： 加速体外体细胞突变的诱导，可用于体外高致突变性测试，包括在细胞中表达表达DNA的修饰DNA，该DNA表达活化诱导的胞苷脱氨酶基因的修饰形式
机译： 质粒表达于人或其突变蛋白的DNA酶I的非活性前体-大肠埃希菌类细菌细胞中;属于埃希氏菌属的细菌，-人或其突变蛋白重组DNA酶I的非活性前体的生产者;人或其突变蛋白的重组DNA酶I的前体;获得人或其突变蛋白的重组DNA酶I的方法;获得人DNA酶I的聚乙二醇和重组蛋白的结合物，人重组DNA酶I的发酵性活性结合物的方法
