诱骗受体3的基因构建表达纯化和特异性鉴定方法

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。

诱骗受体3基因的构建采用如下方法。

1)设计引物：

从GenBank(AY358279)上查得DcR3 cDNA全序列，获取编码DcR3的原始基因序列

ATGAGGGCGCTGGAGGGGCCAGGCCTGTCGCTGCTGTGCCTGGTGTTGGCGCTGCCTGCCCTGCTGCCGGTGCCGGCT

GTACGCGGAGTGGCAGAAACACCCACCTACCCCTGGCGGGACGCAGAGACAGGGGAGCGGCTGGTGTGCGCCCAGTGC

CCCCCAGGCACCTTTGTGCAGCGGCCGTGCCGCCGAGACAGCCCCACGACGTGTGGCCCGTGTCCACCGCGCCACTAC

ACGCAGTTCTGGAACTACCTGGAGCGCTGCCGCTACTGCAACGTCCTCTGCGGGGAGCGTGAGGAGGAGGCACGGGCT

TGCCACGCCACCCACAACCGTGCCTGCCGCTGCCGCACCGGCTTCTTCGCGCACGCTGGTTTCTGCTTGGAGCACGCA

TCGTGTCCACCTGGTGCCGGCGTGATTGCCCCGGGCACCCCCAGCCAGAACACGCAGTGCCAGCCGTGCCCCCCAGGC

ACCTTCTCAGCCAGCAGCTCCAGCTCAGAGCAGTGCCAGCCCCACCGCAACTGCACGGCCCTGGGCCTGGCCCTCAAT

GTGCCAGGCTCTTCCTCCCATGACACCCTGTGCACCAGCTGCACTGGCTTCCCCCTCAGCACCAGGGTACCAGGAGCT

GAGGAGTGTGAGCGTGCCGTCATCGACTTTGTGGCTTTCCAGGACATCTCCATCAAGAGGCTGCAGCGGCTGCTGCAG

GCCCTCGAGGCCCCGGAGGGCTGGGGTCCGACACCAAGGGCGGGCCGCGCGGCCTTGCAGCTGAAGCTGCGTCGGCGG

CTCACGGAGCTCCTGGGGGCGCAGGACGGGGCGCTGCTGGTGCGGCTGCTGCAGGCGCTGCGCGTGGCCAGGATGCCC

GGGCTGGAGCGGAGCGTCCGTGAGCGCTTCCTCCCTGTGCACTGA，其中加横线部分代表信号肽；

然后去除N端29个信号肽序列，根据密码子的简并性和大肠杆菌的密码子喜好性原则，在不影响氨基酸序列的前提下，将DcR3的核苷酸序列修改为：

TAGGCCATGGATGTGGCAGAAACACCGACCTACCCGTGGCGTGACGCAGAGACAGGGGAACGTCTG

GTGTGCGCCCAGTGTCCGCCAGGCACCTTTGTGCAGCGTCCATGCCGCCGTGACAGCCCGACGACG

TGCGGCCCATGTCCTCCGCGCCATTACACCCAGTTCTGGAACTACCTGGAGCGCTGTCGCTACTGCA

ACGTCCTGTGCGGTGAGCGTGAGGAGGAGGCACGTGCTTGCCATGCCACCCATAACCGCGCCTGCC

GCTGCCGCACCGGCTTCTTCGCGCATGCTGGTTTCTGCTTGGAGCATGCATCTTGTCCACCGGGTGC

CGGCGTGATTGCCCCGGGCACCCCGAGCCAGAACACGCAGTGCCAACCGTGCCCGCCGGGTACCTTC

TCAGCCAGCAGCTCCAGCTCAGAGCAATGCCAGCCGCATCGCAACTGCACGGCCCTGGGCCTGGCC

CTCAATGTGCCGGGCTCTAGTTCCCATGACACCCTGTGCACCAGCTGCACTGGCTTCCCGCTCAGCAC

CCGTGTACCGGGAGCTGAGGAGTGTGAACGTGCCGTCATCGACTTTGTGGCTTTCCAGGACATCTCC

ATCAAGCGTCTGCAGCGGCTGTTGCAAGCCTTAGAGGCCCCGGAGGGCTGGGGTCCGACACCGCGTG

CGGGCCGCGCGGCCTTGCAGCTGAAGCTGCGTCGTCGTCTCACGGAGCTCCTGGGGGCGCAGGACG

GGGCACTGCTGGTGCGTCTGTTACAGGCGCTGCGCGTGGCCCGTATGCCCGGGCTGGAACGTAGCGT

TCGTGAGCGCTTCTTACCGGTGCATCTCGAGCTCT，其中加横线部分代表酶切位点；

将修改后的DcR3序列分成12个长引物片段，分别命名为F1，R2，F3，R4，F5，R6，F7，R8，F9，R10，F11，R12，每条引物之间有12个碱基互补，利用引物F1和R12引入NcoI和XhoI酶切位点。DcR3引物详见表1，在表1中，加粗碱基是改变后的碱基位点。

2)获取DcR3基因：

(1)第1轮PCR反应：将两条引物F1、R2，F3、R4，F5、R6，F7、R8，F9、R10，F11、R12既作为引物，又作为模板，分别生成产物D1、D2、D3、D4、D5、D6；反应体积为50μl，反应体系为：10×Buffer(with Mg²⁺)为5μl，pfu酶为0.5μl，dNTP(2.5mmol/L)为4μl，引物(50umol/L)F1，F3，F5，F7，F9，F11为0.5μl，引物(50umol/L)R2，R4，R6，R8，R10，R12为0.5μl；用灭菌超纯水补齐至50μl，立即进行PCR扩增，反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性35s，72℃延伸1min，循环30次，72℃延伸10min；

(2)第2轮PCR反应：以D1与D2为模板、引物，合成产物D7；以D3与D4为模板、引物，合成产物D8；以D5与D6为模板、引物合成产物D9；

(3)第3轮PCR反应：以D8与D9为模板引物，合成产物D11；

(4)第4轮PCR反应：以D7与D11为模板、引物，合成产物D12；用灭菌超纯水补齐至100μl，立即进行PCR扩增，PCR反应条件均为：95℃变性4min；95℃变性40s，58℃退火45s，72℃延伸1min，循环30次；72℃延伸10min，反应结束后，取5μlPCR产物经1.2％琼脂糖电泳鉴定，紫外灯下观察结果。

以下通过重组体的构建、表达、纯化和特异性鉴定以证实DcR3基因序列的有效性。

1)构建DcR3重组体：

(1)PCR产物的纯化回收：参照Agaose Gel DNA Extraction Kit说明进行；

(2)PCR产物与pET-22b(+)载体的酶切回收：将pET-22b(+)载体和已纯化回收的PCR产物分别用Nco I和Xho I酶切，酶切体积为50μl，于37℃酶切6h，得到酶切产物；

(3)酶切产物的纯化回收：参照Agaose Gel DNA Extraction Kit说明进行；

(4)连接目的基因与载体：连接反应按T4DNA连接酶的说明书进行，反应体积为10μl，于16℃连接过夜，得到DcR3重组体。

2)DcR3重组体的表达：

(1)转化DcR3重组体：

a.按常规方法制备感受态细胞；

b.按常规方法重组体转化E.coli Rosseta-gami菌。

(2)阳性重组质粒的表达鉴定：

a.菌落PCR的初步鉴定：挑单菌落到含有20μl超纯水的离心管中，于水浴锅中煮沸10min后，离心，取上清做模板，以pET-22b(+)载体的T7 promoter(T7 UP)和T7 terminator(T7 DW)为引物进行菌落PCR初步鉴定，反应体积为50μl。反应程序为：95℃预变性4min；95℃变性40s，56℃退火45s，72℃延伸1min，循环35次；最后72℃延伸10min，反应结束后，取5μl PCR产物经1.2％琼脂糖电泳鉴定，紫外灯下观察结果，若T7引物和特异引物为阳性，则进入下一步骤，若T7引物和特异引物为阴性，则重新鉴定；

b.质粒的小量提取：经菌落PCR初筛后，阳性克隆再提质粒，质粒的小量提取参照Plasmid Mini Kit说明进行；

c.重组质粒的酶切鉴定：用限制性内切酶Nco I和Xho I分别对所提取的质粒进行单酶切和双酶切鉴定，酶切反应体系参照上述酶切产物的纯化回收步骤操作方法进行，将酶切后的产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳进行检测分析；

d.序列测定：将经菌落PCR初筛和酶切鉴定的阳性重组质粒测序，测定结果用DNAstar软件进行基因序列分析，若测序结果正确，则进入下一步骤，若测序结果不正确，则重复阳性重组质粒的鉴定。

(3)诱骗受体3蛋白的原核表达：

a.诱骗受体3蛋白的诱导表达：挑选测序正确的重组质粒pET-22b(+)/DcR3的E.coliRosseta-gami单菌落，37℃ 250 rpm/min振荡培养过夜，1∶100放大培养到A₆₀₀值0.6～0.8时，加入IPTG进行诱导表达，并且用不同IPTG浓度、不同的诱导时间进行诱导，筛选出高表达的阳性克隆。IPTG终浓度为0.7mmol/L时，诱导7h表达量最高，以相同条件下不加IPTG诱导的菌株和IPTG诱导含空载体的菌株作为对照；

b.表达产物的SDS-PAGE电泳鉴定：将诱导后的菌样10000r/min离心1min，弃上清，沉淀用1/10菌液体积的TE溶液(50mM Tris、2mM EDTA，pH8.3)重悬，加入1×SDS凝胶上样缓冲液，混匀，煮沸5分钟，离心取上清留样备用。表达量高的阳性克隆菌，培养，收集菌体，进行超声波破碎，上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳。经考马斯亮蓝染色，观察结果；

c.表达产物包涵体的洗涤：收集的菌体加入适量含0.1％溶菌酶、1％Triton X-100的TE缓冲液，制成悬液，静置20min。冰浴下超声，直至溶液上清变得澄清。12000r/min离心10min，收集上清留样用；沉淀用适量含有2M尿素的TE缓冲液重悬，室温下搅拌30min，12000r/min离心10min，收集沉淀。重复洗涤一次。收集的沉淀用TE洗涤一次。最后用50mM PB pH7.0缓冲液洗涤沉淀，室温搅拌30min，12000r/min离心20min，收集沉淀，得到表达产物包涵体；

d.表达产物包涵体的溶解：在表达产物包涵体中，加入含有8mol/L尿素、2mmol/L β-巯基乙醇的TE溶液，搅拌，直至包涵体完全溶解，15℃、7000r/min离心10min，取上清，置40℃水浴15min，冷却至室温备用。

3)Ni²⁺柱的装配及包涵体的纯化：

(1)将溶于乙醇的树脂重新悬浮；

(2)吸取2ml装于配套的纯化柱中，静置至树脂沉积；

(3)打开柱阀门，待柱中液体流干后，用5倍柱体积的超纯水洗涤3～5次，除去乙醇；

(4)加入5倍柱体积的charge buffer(50mM NiSO₄)充电，使Ni²⁺鳌合于树脂上；

(5)倍柱体积的超纯水洗涤3～5次，去除多余游离的Ni离子；

(6)加入5倍柱体积的bingding buffer(20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，5mM咪唑，pH8.0)平衡电荷；

(7)将经过处理的样品过柱；

(8)10倍柱体积的Binding Buffer和Wash buffer(20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，60mM咪唑，pH8.0)充分洗涤，去除非特异性结合的蛋白质；

(9)加入Elute Buffer(20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，1M咪唑，pH8.0)将目的蛋白洗脱，收集各管进行12％的SDS-PAGE电泳；

(10)10倍柱体积的Binding Buffer洗涤。

4)蛋白复性：收集融合蛋白，转入透析袋在50倍体积的透析液(0.01M PBS pH8.0，0.5％甘油)4℃透析复性(24h)，每4h换一次透析液，透析完毕用聚乙二醇浓缩。

本发明所述的诱骗受体3蛋白的特异性鉴定可采用ELISA方法，其步骤为：

1)用表达产物(100μg/L)包被酶标板100μL/孔，3孔，分别记为A、B、C，4℃过夜，以BSA(10mg/L)作为阴性对照，同时设空白对照；

2)每孔加200μL含10g/LBSA的PBS，37℃封闭1h；

3)在A、B、C孔中分别加1∶1000稀释的兔抗DcR3-IgG抗体、FUM1.4、FUM1.5，37℃温育1h；

4)加1∶100稀释的HRP标记的鼠抗兔IgG抗体，37℃温育0.5h；

5)加入TMB底物液，避光显色15min，以2mol/L H₂SO₄终止反应；

6)酶标检测仪测定A₄₀₅；

7)重复上述步骤1)～6)3次；

8)用所测得的A值按公式：

P/N值＝(被检样品A值-空白对照A值)/(阴性样品A值-空白对照A值)

计算P/N值，以样品的P/N值≥2.1判为阳性。

DcR3重叠PCR结果参见图1。

以下给出重组质粒的酶切鉴定结果。

重组子质粒经NcoI及XhoI酶切后，琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到目的条带分别为DcR3条带(813bp)、pET-22b(+)条带(5 482bp)(参见图2)。测序结果表明载体构建正确。

以下给出DcR3在大肠杆菌中的表达及纯化结果。

含重组质粒pET-22b(+)/DcR3的E.coli Rosseta-gami经IPTG诱导表达后，通过不同的诱导时间和诱导剂浓度对重组菌进行诱导表达，确定其最适表达条件为IPTG终浓度为0.7mmol/L、37℃诱导7h。目的蛋白主要以包涵体形式存在，表达量占菌体总蛋白的30％以上。洗涤并溶解包涵体，离心取上清过Ni柱纯化。经SDS-PAGE分析在Mr33 000附近有一特异条带，符合目的蛋白理论推算值(Mr约32700)，扫描分析显示其纯度达95％以上(参见图3)。

通过ELISA鉴定，纯化后得到的蛋白可以同抗DcR3-IgG抗体特异结合，与Anti-DR4mAb FUM1.4、Anti-DR5 mAb FUM1.5没有特异结合，3次所测得的结果均相同，其P/N值分别为3.43、3.39、3.28，均大于2.1，说明复性后的融合蛋白是纯化的DcR3蛋白。