抗棉花枯、黄萎病蛋白质BS2的分离纯化及其基因BS2的克隆

技术领域

本发明涉及一种抗棉花枯萎病、黄萎病的枯草芽孢杆菌B111，来源于该菌的BS2蛋白及其相关BS2基因序列。该菌及其BS2蛋白对棉花黄萎病菌和枯萎病的生长具有一定抑制作用。该BS2蛋白可用于生物农药或生防制剂的研究。该BS2基因可用于转基因棉花抗病性表达研究。

背景技术

植物病害是世界粮食减产主要原因之一，每年在农作物生产中造成10％～15％的产量损失，棉花损失为12％左右(Hainr and P.H.Schireier，Journal of.Pflanzenschutz-Nachrichten Bayer，(special issue)，49(67)：25-120，1996)。其中植物真菌病害位于植物四大病害(真菌、细菌、病毒和线虫(郑秀芳等，甘肃科学学报，13(1)：63-66，2002))之首，占植物病害总数的80％以上(罗闫良等，生物学杂志，(6)：6-8，1994)。而被称为棉花的两大“癌症”的枯萎病和黄萎病是棉花生产最重要病害之一。尖孢镰刀菌萎蔫专化型(Fusariumoxysporum f.sp.vasinfectum)侵染引起的棉花枯萎病是棉花的主要病害之一，对棉花产量和品质造成极大影响。同时由黑白轮枝菌、大丽轮枝菌浸染后引起的棉花黄萎病(Verticillium dahliaeKleb)是继枯萎病之后人们发现的又一重要棉花病害，广泛分布于世界各产棉国。我国棉花黄萎病自1935年由引进美国棉花品种而传入，近10年来，棉花黄萎病发生日趋严重，重病地棉花减产60％～70％，有的甚至绝收，已严重阻碍了我国棉花生产的发展(房卫平等，河南农业科学，(1)：7-9，1998；李培夫，新疆农垦科技，(2)：12-13，1998)。特别是近年出现了类似于美国T9落叶型强致病黄萎病菌，对我国棉花黄萎病危害更为严重，不仅流行区域不断扩大，而且损失更加严重。棉花落叶型黄萎病成为继虫害之后影响我国棉花获得高产、稳产的主要障碍和棉花生产可持续发展的主要问题之一。因此，必须尽快选育抗落叶型黄萎病、枯萎病棉花品种，控制蔓延、阻止延缓病菌的变异，防止枯萎病、黄萎病大规模流行，避免对我国棉花生产带来灾难性的损失。

本发明从中药白豆蔻中分离到一株细菌，命名为B111。平板拮抗实验结果显示该菌能强烈抑制黄萎病及枯萎病的生长。通过生理生化试验及16S rRNA鉴定结果确定B111属于枯草芽孢杆菌。对该菌的胞外发酵液进行分离纯化，并结合平板拮抗试验，发现该菌分泌的一种蛋白(命名为BS2)对落叶型黄萎病菌V991和E.coli的生长均有抑制作用，对毕赤酵母无影响。同时对枯萎病Ag226的生长也有一定的抑制作用。利用联机反相毛细管柱液相色谱电喷雾串联质谱CapLC-ESI-MS-MS获得BS2蛋白的五条多肽的氨基酸序列，二级质谱数据库分析结果显示在该蛋白与芽孢杆菌中性蛋白酶(BacillolysinEC 3.4.24.28)同源性较高，可能为一种新的芽孢杆菌中性蛋白酶。根据所测氨基酸测序结果及其同源序列设计引物，获得了BS2蛋白1.9kb的全基因序列。

经检索目前还没有关于枯草芽孢杆菌中性蛋白酶对真菌具有抗性的报到。但陈云等人(陈云等，功能高分子学报，12(3)：293-296，1999)报道了中性蛋白酶能非特异性的水解壳聚糖并对其反应条件进行了研究。壳聚糖广泛存在于真菌中，是真菌细胞壁的重要组成部分。这可能就是抗菌蛋白BS2能抑制黄萎病菌生长的原因之一。

发明内容

本发明提供一种防治棉花枯萎病、黄萎病的菌株：Bacillussubtilis B111(保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所；保藏编号：CGMMCC No.1497；保藏日期：2005年10月18日；分类命名：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis)。

本发明的另一目的是提供一种来源于枯草芽孢杆菌B111的与棉花枯萎病、黄萎病相关的基因：BS2基因。

本发明提供的BS2基因，是下列核酸列之一：

1)序列表中的SEQ ID NO：1；

2)与序列表中SEQ ID NO：1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码具有抗棉花枯萎病、黄萎病功能的蛋白质的DNA序列。

序列表中的SEQ ID NO：1由1908个碱基组成。该基因的读码框为SEQ ID NO：1自5’端第254位到第1819位碱基。

本发明的再一个目的是提供一种由抗棉花枯萎病、黄萎病相关的BS2基因编码的具有抗菌功能的蛋白质，是序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列，或将SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列相同活性的由序列SEQ ID NO：2衍生的蛋白质。

序列表中的SEQ ID NO：2是由521个氨基酸组成的蛋白质。

含有本发明基因的表达载体及细胞系均属于本发明的保护范围。

可以将本发明的BS2基因导入棉花等植物中，以期获得对枯萎病、黄萎病具有抗性的转基因棉花。本发明的基因对培育抗逆植物品种，特别是抗棉花枯萎病、黄萎病的植物品种，提高作物产量和品质具有重要意义。

下面结合附图对本发明做进一步说明

附图表说明

图1：QAE sephadex A50强阴离子交换柱洗脱曲线。

图2：SDS-PAGE蛋白电泳图。图中1、2、3、4分别代表B111的蛋白粗提液、B111的发酵原液，洗脱峰1收集液、洗脱峰2(即BS2蛋白)收集液。

图3：牛津杯抑菌实验图。(A)：枯草芽孢杆菌B111对落叶型黄萎病V991的抑制作用；(B)：用90％硫酸铵沉淀B111发酵液后的粗提蛋白对黄萎病V991的抑制作用；(C)洗脱峰1收集液对黄萎病V991的抑制作用；(D)洗脱峰2(即BS2)收集液对黄萎病V991的抑制作用。

图4：利用MALDI-TOF-MS测定的BS2蛋白的分子量。

图5：采用MALDI-TOF-MS测定的BS2蛋白的肽指纹图谱(PFM)。

图6：金属离子激活实验图。(A)BS2蛋白缓冲液(20mmol/LTris-HCl，pH 7.0)中未加锌离子的抑菌效果；(B)BS2蛋白缓冲液中添加锌离子后(20mmol/L Tris-HCl，2mmol/L Zn²⁺，pH 7.0)的抑菌效果。

图7：根据氨基酸测序结果及其二级质谱数据库搜索结果设计引物，扩增到了BS2蛋白对应的729bp的核酸序列(泳道1)。

图8：根据同源序列设计引物，获得了BS2基因的全长DNA序列1908bp(泳道1)。

具体实施方式

实施例1抗菌蛋白BS2的分离纯化

1枯草芽孢杆菌B111的培养及发酵液的处理

将枯草芽孢杆菌B111接种到灭菌的LB培养基(酵母粉5g/l，酸水解酪素25g/l，NaCl10g/l，pH7.0)中，37℃，250rmp，培养24h后，将拮抗菌B111发酵液置于离心瓶中，4℃、12000rpm离心20分钟，弃取沉淀，保留上清。

体I2抗菌蛋白BS2的分离、纯化

采用分子截流量为20KD的超滤器对枯草芽孢杆菌B111发酵液上清进行浓缩。根据浓缩后发酵液的体积称取一定量的硫酸铵(盐终浓度达到90％)，在加入前须将硫酸铵用研钵研成粉状，在4℃下缓慢加入到离心后的浓缩发酵液中，边加边搅拌，缓慢进行，避免局部浓度过高，造成蛋白质沉淀不均匀。搅拌2小时后，将其置于4℃冰箱中沉淀过夜。次日将粗提液于4℃、15000rpm离心40分钟，保留沉淀，弃取上清。然后用少量缓冲液(20mmol/L Tris-HCl，pH 7.0)溶解沉淀，再置于透析带(10mm，MWCO 1000Da)中24h，进行脱盐处理(先用纯水透析2小时，再换用同样缓冲液透析)。透析完毕后，取20ul进行电泳验证提取效果，并取适量进行抑菌实验。采用强阴离子交换柱(填料：QAEsephadexA50；柱型：0.9×30cm；洗脱液：溶液A：20mmol/L Tris-HCl，pH 7.0，溶液B：1mol/LNaCl，pH7.0)对蛋白粗提液进行连续梯度洗脱(pH不变，增加洗脱液离子强度)，洗脱流速为1ml/min，检测波长为280nm。分别收集每个洗脱峰的洗脱液，注意收集过程在4℃条件下进行。经梯度洗脱共获得两个洗脱峰(图1)，将每个洗脱峰的洗脱液分别置于透析带(10mm，MWCO 1000Da)中24h，进行脱盐处理(先用纯水透析2小时，再换用同样缓冲液即溶液A中透析)。最后采用PEG20000对每个透析带(10mm，MWCO 1000Da)中的液体进行浓缩。采用分离胶为15％的SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度(图2)。

实施例2抑菌活性鉴定

1落叶型棉花黄萎病菌V991的培养：

取适量斜面上的V991置于200ul的无菌水中，制成孢子悬液均匀涂在Czapek’s平板培养基上，在28℃培养5天。再将10ml无菌水加到平板上，混匀后将该高浓度孢子悬液加到100ml无菌水中，制成OD₅₉₅＝0.795的孢子悬液，按每管1ml分装后存于4℃备用。

2抑菌活性的检测

取200μl配好的V991孢子悬液均匀涂抹在Czapek’s(KNO₃1.36g/L，NaCl 1.38g/L，KH₂PO₄lg/L，FeSO₄0.02g/L，蔗糖30g/L，琼脂粉15g/L)平板培养皿(直径90cm)中，并在平板中等距离放置牛津杯，每个牛津杯中加入100μl蛋白样品，对照组则加入100μl缓冲液(20mmol/L Tris-HCl，pH 7.0)。置于28℃培养，第二天样品吸收后取出牛津杯，继续在28℃培养4天观察加有蛋白质样品和对照的棉花黄萎病菌的生长情况(图3)。抑菌试验证明洗脱峰2的收集液能抑制落叶型黄萎病V991的生长，SDS-PAGE电泳检测结果显示洗脱峰2为单一蛋白，分子量约为36kD。因此初步认为该蛋白即为抑菌蛋白，命名为BS2。

实施例3抗菌蛋白BS2的鉴定

利用MALDI-TOF-MS测定了BS2蛋白的分子量及其肽指纹图谱(PFM)(图4、5)。测定的BS2分子量为32048.979Da。同时采用联机反相毛细管柱液相色谱电喷雾串联质谱CapLC-ESI-MS-MS获得BS2蛋白的五条多肽的氨基酸序列(表1)，利用Mascot在二级质谱库中获得有意义的搜索，结果显示该蛋白与两个蛋白质(水解淀粉芽孢杆菌中性蛋白酶前体HYBSN gi|67706和芽孢杆菌B16中性蛋白酶前体bael6 AAV30844 gi|54126578)具有同源

这两个同源性蛋白都属于芽孢杆菌中性蛋白酶，且这两个同源性蛋白之间同源性高达89％。同时所测得的5条多肽的氨基酸序列都位于同源蛋白的成熟蛋白区域。此外，BS2蛋白分子量也与该类芽孢杆菌中性蛋白酶的成熟蛋白分子量基本相符，都约为32-33kD。因此推断BS2可能是一种新的芽孢杆菌中性蛋白酶。

表1BS2测序结果与同源序列的比较

实施例4抗菌蛋白BS2抑菌活性的激活

对芽孢杆菌中性蛋白酶的性质分析发现(Bacillolysin EC 3.4.24.28)，该类酶为金属蛋白酶，它有两种金属离子结合位点即三个锌离子和一个钙离子结合位点，其反应特性类似于嗜热菌蛋白酶。而锌离子与嗜热菌蛋白酶的酶活性有关，钙离子与酶的稳定性有关。因此可能由于纯化过程中丢失了必需的金属离子导致酶活性较蛋白粗提物有所降低。因而分别在蛋白缓冲液中添加了锌离子和钙离子，使金属离子终浓度达到2mmol/L，再进行抑菌试验测试。试验结果显示钙离子对BS2蛋白抑菌活性没有明显激活作用，而锌离子对该蛋白的抑菌活性有一定激活作用(图6)。

实施例5BS2基因的克隆

1从测序所得氨基酸序列中选取最靠近N-端和C-端的两段序列(TVSLNISSE和KAEQIYYR)作为特异引物，设计引物F1：5’-ACGG TCTCATTAAATAATTCTTCTGAA-3’，R1：5’-ACGATAGTAAATCTGCTCCGCTTT-3’，以B111基因组DNA为模板进行PCR(图7)，获得了约700bp左右的核酸片段。从引物F1编码的第一个氨基酸T(235位)到引物2编码的最后一个氨基酸R(477位)之间应包含243个氨基酸序，对应的DNA序列应为729bp.对PCR结果测序显示与预计相符，该片段长度为729bp。将该序列根据细菌偏好密码子翻译成氨基酸序列，其氨基酸序列的理论酶切图谱与BS2肽指纹图谱PMF高度吻合，则认为已经获得抗菌蛋白基因的部分序列。

2此后根据已知的同源序列水解淀粉芽孢杆菌中性蛋白酶前体HYBSN gi|67706设计同源引物，F2：5′-GATCTTAACATTTTTCCCCTATCATTT---3′；R2：5′-CGGGAA AAGACATATATCATCATGGT-3’，获得了编码该蛋白的BS2基因的全长序列1908bp(图8)。该序列的开放阅读框自5’端第254位到第1819位碱基。共编码521个氨基酸，其中与同源序列比较可预测1-27个氨基酸为信号肽，28-221位氨基酸位前体肽，222-521位氨基酸为成熟蛋白区域即芽孢杆菌中性蛋白酶。