一种体外诱导人骨髓基质干细胞构建软骨的方法

具体实施方式

本发明人在严谨的实验工作中发现，hBMSCs获取容易，可以通过密度梯度离心或者贴壁法分离出骨髓中的hBMSCs，经体外的扩增后细胞数量明显增加，在第2代时可达到原细胞量的30-100万倍，对细胞进行特性鉴定发现细胞仍能够保持干细胞特性，具有自我更新的能力，更为重要的是细胞能够在TGF-β₁、地塞米松和IGF-I等生长因子联合诱导下分化为软骨样细胞，并能够分泌II型胶原和蛋白聚糖。说明这种细胞具备作为软骨构建种子细胞的条件，进而将细胞接种到PGA为主要材料做成的三维多孔支架上，再进行三维诱导培养，发现细胞能够很好地与材料粘附并分泌蛋白聚糖和II型胶原等软骨特异性细胞外基质，在基质逐渐增多包埋细胞和支架的同时，PGA纤维等支架逐步降解消失，最终在体外形成了成熟的软骨组织，这完全符合组织工程技术的基本原理。为了解这种成体干细胞构建的软骨能否在皮下环境中长期存留，我们将体外构建4周的软骨植入裸鼠皮下，4周后发现植入的软骨仍能够保持原有的大小和形状，而且生物力学性质有了明显改进。最近，体外构建较大的片状软骨(30mm×20mm)也获得成功。

人们注意到骨髓基质中有一类被称为是“骨髓间充质干细胞(BMSCs)”的非造血细胞亚群，这些细胞能够在体内或体外进行扩增和诱导，最终分化为成骨细胞、脂肪细胞、肌腱细胞、神经细胞和生血基质等。在有地塞米松、TGF-β₁、TGF-β₃等诱导因子存在下，BMSCs亦能在体外直接被诱导成为软骨样细胞。相比软骨细胞，BMSCs具有更多的优点，它们来源广泛，取材时供区损伤轻微，在体外又能够大量扩增，最终可得到活力好、数量充足的细胞。这为我们构建自体或同种异体软骨提供了一个新的种子细胞来源。

术语

本发明所用的术语“骨髓间充质干细胞(BMSCs)”和“骨髓基质干细胞”可相互替换使用。

术语“hBMSCs的分离”指将存在于动物骨髓中的基质干细胞由骨髓的多种细胞群体中选取出来的过程。

术语“hBMSCs的扩增”指为了获取大量hBMSCs而在体外环境中大量增殖的过程。

术语“诱导”指提供特殊的生化环境，将具有多向分化能力的干细胞等细胞群体转变为另一种功能特性不同的细胞群体的过程。

术语“接种”指将细胞均匀分布于三维支架材料上的过程。

术语“自体移植”指将所需生物活体材料(如骨髓基质干细胞)从某个体中取出并再施用于同一个体的过程。

术语“直接脉冲式滴加”指将生长因子按着要求剂量配制好之后直接滴加在细胞材料复合物上，然后后添加培养液，间隔一段时间后重复滴加生长因子。

hBMSCs

本发明中hBMSCs的来源没有特别限制，一种优选的来源是来自自体的骨髓。

分离获得hBMSCs的方法是文献多次报道的公认方法。一种优选的方法是全麻下或局麻下骨髓穿刺抽取自体骨髓，以密度梯度离心法分离出其中的有核细胞，加入适合的培养液(如含有10％胎牛血清，L-谷氨酰胺300ug/ml，维生素C50ug/ml，青、链霉素各100U/ml的DMEM培养液)，制成细胞悬液，以约2×10⁵/cm²的密度接种于培养皿，于37℃、5％CO₂、100％饱和湿度的条件下培养。48小时后首次换液，以后隔日换液继续培养。待细胞生长近汇合后，以0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化，以1×10⁴/cm²的密度接种进行细胞传代。优选第2～15代细胞用于制备人工软骨。

一类优选的hBMSCs分离培养方法是全骨髓分离培养法，在抽取骨髓后进行多次洗涤，以约6×10⁵个有核细胞/cm²的密度(但不仅限于此密度)经上述培养液稀释后接种于培养皿中，静态培养5天左右，使多数骨髓基质细胞(包括骨髓基质干细胞)充分贴壁，再经多次冲洗和换液去除红细胞及其它未贴壁的细胞，待细胞生长近汇合后常规消化、传代，在培养扩增过程中可使hBMSCs逐步纯化。优选体外培养的第2代～第9代hBMSCs进行软骨构建，此时的hBMSCs有较强的增殖能力并具有多向分化的潜能，包括向软骨细胞分化的潜能。

生物可降解材料

可用于本发明的组织工程化软骨的材料是医学上可接受的生物可降解材料，包括(但并不限于)：

(a)可降解性合成高分子材料，例如聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、PLGA、聚羟基丁酸(PHB)、聚酸酐(polyanhydrides)、聚偶磷氮(polyphosphazenes)、聚氨基酸(polyamino acid)、假聚氨基酸(pesudo-polyamino acid)、聚原酸酯(polyorthoesters)、聚酯尿烷(polyesterurethane)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚乙二醇、透明质酸、聚对二氧六环酮(polydioxanone)等；

(b)天然可降解材料，例如胶原(collagen)、明胶(gelatin)、糖氨聚糖(glycosaminoglycan，GAGs)、壳聚糖(chitosan)、甲壳素(chitin)、海藻酸盐以及各种脱细胞基质等；

(c)上述材料的共聚物或复合型材料，尤其是高分子材料与天然材料的复合材料，以及固体材料与可注射性材料的复合材料。

优选的医学上可接受的生物可降解材料是固体材料或固、液体复合材料，例如聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、胶原等。本发明中的材料可预制成各种精确的大小与形状，以适应不同大小和形状的软骨组织构建。当材料为固体型材料时，可以直接将材料预制成需要的大小与形状，也可以通过计算机辅助及快速成型技术定制的模型对材料进行精确的塑性。

hBMSCs-生物材料复合物

本发明中hBMSCs-生物材料复合物的细胞接种浓度通常约为2×10⁷/ml至7×10⁷/ml或更高。材料为固体性材料或者固、液体复合材料，以培养液调整细胞浓度，然后与固体性材料混合，其中混合时培养液与固体性材料的比例没有特别限制，但是以该固体材料所能够吸附培养液的最大量为准。当支架材料为特殊三维形状时，如耳廓或鼻背形，按实际体积的大小来进行计算。

制备方法

本发明的组织工程化软骨的制备方法简便，将一定数量的所述hBMSCs与药学上可接受的生物可降解材料混合，再经体外诱导即可。

在本发明的组织工程化软骨移植物构建软骨过程中，主要以TGF-β₁、IGF-I和地塞米松等生长因子进行体外诱导，也可优选添加或复合其它各种细胞因子或生长因子，如BMP-2、CDMP等，从而加速诱导过程及提高细胞外基质合成能力等。

一定剂量的TGF-β1、IGF-I和地塞米松诱导组合可以高效诱导hBMSCs成软骨分化，但是诱导猪BMSCs的剂量应用于hBMSCs无法达到良好的诱导效能，必须要加大生长因子的应用剂量。在一个优选例中，TGF-β₁的浓度为20-50ng/ml、IGF-I的浓度为100-500ng/ml、地塞米松的浓度为10-60ng/ml可以达到稳定高效的诱导效能。

既往在猪BMSCs接种到材料上7天后开始诱导，但应用于hBMSCs后发现细胞外基质合成量明显低下，在一个优选例中，细胞接种到材料上之后24-48小时开始诱导明显促进胞外基质合成量，增加组织成熟度。

既往对猪BMSCs采取持续性体外诱导剂刺激，但是该诱导方法对hBMSCs的诱导效能不强，优选地，采用直接脉冲式滴加在复合物上的方法，间隔时间为24-48小时，明显增强诱导效能。

本发明的组织工程化软骨移植物构建软骨过程中，主要为静态培养，或者以离心或振荡的方式加入力学刺激，也可以通过软骨生物反应器模拟体内软骨的力学环境，对体外构建的软骨施加类似的力学刺激，促进软骨的成熟与力学性质的改进。

用本发明方法形成的组织工程化软骨，即hBMSCs与固体性生物材料构成的复合物，该复合物经体外充分诱导后可植入体内皮下或软骨缺损部位。

一例用hBMSCs与培养液制成浓度为5×10⁷/ml的细胞悬液(不仅限于此浓度)，然后与聚羟基乙酸(PGA)为主的生物支架材料形成复合物(复合物大小、形状依照软骨缺损的大小及形状确定)。该复合物经体外诱导培养6周至8周(不仅限于此时间，期间每3至4天换液一次，以保证细胞营养)，当体外组织工程化软骨初步形成时植入体内皮下或相应的软骨缺损部位。亦可将材料制作成具有精细结构外形的三维支架，再接种hBMSCs进行体外诱导，经6-8周(不仅限于此时间)后植入体内软骨缺损部位。

应用本发明确定的方法，可以成功诱导hBMSCs构建出了具有良好组织学结构、生物化学组成和力学强度的软骨组织，这种组织能够满足皮下移植不变形的要求。通过这些条件优化组合，取得的诱导效果相当稳定而特异，这为软骨缺损的修复重建提供了坚实的实验基础和技术基础。

应用方法

hBMSCs与可降解固态生物材料形成复合物后，在体外进行诱导培养，当适合软骨缺损大小和形状的组织工程化软骨形成后，再植入体内软骨缺损部位。

本发明的主要优点在于：

(1)应用自体细胞，且一次取材既可获得足够的细胞量；

(2)骨髓穿刺操作简单，对病人损伤极小，无需住院，且可以重复取材；

(3)体外培养方法简单易学，便于推广应用；

(4)体外诱导方法操作简便，诱导效果确切可靠；

(5)可按软骨缺损大小和形状预制移植物的大小和形状，以达到精确的修复；

(6)培养过程便于标准化，易于形成产业化产品。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

hBMSCs的获取和培养

细胞取自人胸骨或者髂骨，供体年龄8-36岁，身体健康，无恶性肿瘤、传染性疾病及血液系统疾病。

(1)取材：麻醉满意后，常规消毒铺巾，16号穿刺针于胸骨或者髂骨部位穿刺，抽取骨髓6～8ml，置于肝素化的离心管中。

(2)分离有核细胞(以密度梯度离心法为例)：将抽取的骨髓先后用5ml和1ml空针反复抽吸数次，转移至另一离心管内，加入少量的无血清DMEM培养液，混匀，3000rpm离心10分钟，轻轻吸除脂肪及大部分上清液，注意不要搅动下方的沉淀物，重新振荡混匀，在另一15ml离心管内加入新鲜配制的Percol分离液(购自Pharmacia公司)，分离液表面轻轻加入上述的骨髓细胞悬液(体积为分离液的一半)，900g离心30分钟，此时离心管内液体分为四层：第一层主要是血清和少量的培养液，第二层为有核细胞层，第三层为Percol分离液，第四层主要是沉淀下来的红细胞。轻轻吸取第二层的有核细胞转移至另一离心管内，加入适量的无血清DMEM培养液洗涤离心二次。

(3)接种：弃上清，细胞以含有10％胎牛血清，L-谷氨酰胺300ug/ml，维生素C50ug/ml，青、链霉素各100U/ml的DMEM(购自Gibco，Gland Island，NY，USA)培养液制成细胞悬液，取少量细胞悬液用4％乙酸等体积稀释破坏残存的红细胞，常规计数有核细胞数，以2.5×10⁵/cm²的密度接种于培养皿，常用的100mm塑料培养皿接种有核细胞1.5×10⁷左右，加入细胞悬液9～10ml既可。

(4)培养与传代：将接种好的培养皿置于37℃、5％CO₂、100％饱和湿度的条件下，培养48小时后首次换液，此时在低倍镜下可清楚地见到多个克隆形成，吸除旧培养液，PBS洗涤2～3次，加入新鲜培养液，继续在相同的条件下培养，隔日更换三分之二量的培养液，一般4～5天后可达到融合状态，可继续传代培养。传代时吸除培养液，以少量PBS洗涤一次，加入1.5-2.0ml的消化液(含0.02％EDTA及0.25％胰蛋白酶的PBS)，镜下见大部分细胞胞质回缩、形态变圆后，轻轻吸除消化液，加入适量的含血清的DMEM条件培养液中止消化，收集细胞悬液、计数，以1.5×10⁴/cm²细胞密度接种于新的培养皿内，继续在相同的条件下培养。隔日更换三分之二量的培养液，一般4～5天后又可达到融合状态，可继续传代培养。以第2～6代细用于实验效果较佳。

倒置显微镜下观察，hBMSCs呈长梭形或多角形，原代细胞多呈克隆样生长，传代后可形成单层，细胞接近会合时排列呈旋涡形。

实施例2

PGA三维支架的制作

无纺PGA纤维购自Albany公司(Albany，NY，USA)，真空保存。纤维直径13-15μm。将PGA纤维精确称量为6mg/块，用特制的模具压制成直径5mm、厚2mm的圆柱体小块，待形状固定后，将材料支架完全浸入到75％乙醇中消毒30分钟。PBS冲洗3遍，再用含10％胎牛血清的DMEM培养基浸泡10分钟，吸干后准备接种细胞。

实施例3

细胞接种、复合物诱导培养

单层培养的第二代hBMSCs达到90％汇合时，应用0.25％胰酶+0.02％EDTA消化。细胞收集后用细胞计数仪计数，台盼蓝染色显示活细胞数多于95％，1500rpm离心5min使细胞沉淀，弃去上清液，振荡分散细胞，按5×10⁷个细胞/cm³的密度将细胞悬液接种到圆柱形支架上。共制作24块hBMSCs-PGA复合物，均于接种后在37℃、5％CO₂、100％湿度的环境中静态培养24小时。其中20块复合物培养液应用软骨诱导液直接脉冲式滴加诱导刺激，具体成分包括：高糖DMEM，10％FBS，50ng/ml TGF-β₁，100ng/ml IGF-I和40ng/ml地塞米松。其余4块复合物继续应用DMEM培养基。所有构建复合物在体外培养8周后取材检测。

(a)、大体观察

体外诱导培养4周时，诱导组细胞-材料复合物能够保持原有的大小和形状，外观已类似软骨组织，质地柔韧并有一定弹性；未诱导组细胞-材料复合物明显缩小变形，暗褐色，质地柔软无弹性。8周后，复合物仍能够维持原大小与形状，外观上与正常软骨更为接近，硬度与弹性均有所提高。见图1

(b)、组织学检查

HE染色：体外诱导4周时即可见软骨陷窝样结构，但成熟的软骨陷窝数量少，PGA纤维仍较多见，中央部位无细胞和基质沉积，未诱导组含有大量纤维组织和支架材料，极少见到成熟的软骨陷窝样结构。8周后，成熟软骨陷窝数量明显增多，胞外基质染色加深。见图2

Safranin-O染色：本发明培养组新生软骨均有阳性染色。见图3

甲苯胺蓝染色：体外诱导培养组细胞外基质中均有大量胶原沉积，而未诱导组染色明显偏淡。见图4

II型胶原免疫组化：体外诱导培养组细胞外基质中较强阳性表达，表明有大量软骨特异性II型胶原沉积，而未诱导组为阴性。见图5

实施例4

细胞-生物支架复合物形成及体内植入与取材

单层培养的第二代hBMSCs达到90％汇合时，应用0.25％胰酶+0.02％EDTA消化。细胞收集后用细胞计数仪计数，台盼蓝染色显示活细胞数多于95％，1500rpm离心5min使细胞沉淀，弃去上清液，振荡分散细胞，按5×10⁷个细胞/cm³的密度将细胞悬液接种到圆柱形支架上。共制作24块hBMSCs-PGA复合物，均于接种后在37℃、5％CO₂、100％湿度的环境中静态培养24小时。其中20块复合物培养液应用软骨诱导液直接脉冲式滴加诱导刺激，具体成分包括：高糖DMEM，10％FBS，50ng/mlTGF-β₁，100ng/mlIGF-I和40ng/ml地塞米松。其余4块复合物继续应用DMEM培养基。4周后所有构建复合物行裸鼠皮下移植，体内培养4周后取材，对所形成的软骨组织进行评价。

大体观察及组织学检查

体内植入4周后，诱导后的细胞材料复合物可在裸鼠皮下形成组织工程化软骨，新生软骨均呈乳白色，质实，有一定的弹性，周围包绕软组织膜，未见明显的血管长入软骨内。并且构建组织与正常软骨组织学形态相近，均有成熟的软骨陷窝形成，软骨特异性胞外基质均染均匀而丰富(图6，7)。

讨论

通过上述实例可以证实，hBMSCs与PGA三维支架材料制成的细胞-材料复合物，在体外培养过程中持续性给予TGFβ₁、IGF-I等外源性生长因子以及甾体类激素的刺激与诱导，8周时能够形成结构完整的成熟软骨组织，并在软骨组织形成过程中PGA逐渐被降解；未诱导组细胞-材料复合物在培养过程中逐渐收缩，组织学及免疫组化结果只见到及少量的软骨样组织形成。这表明接种在三维支架上的hBMSCs在TGFβ₁等诱导因子作用下可以被诱导成为软骨样细胞，并且分泌软骨的细胞外基质成分，最终在体外形成成熟的软骨组织。

为观察hBMSCs构建的组织工程化软骨能否在体内皮下环境中较长期存留且保持一定的外形，我们将体外诱导培养4周时构建的软骨样组织植入裸鼠皮下，体内4周后发现所形成的组织更加接近于体内正常软骨组织，说明体外构建的软骨完全可以用于体内移植及软骨缺损的修复。这些结果充分证实了体外应用生长因子诱导hBMSCs构建软骨组织是可行的。当然，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。如果再结合转基因技术与生物反应器技术，则体外构建的软骨会更加成熟，而且成本也会大大降低，并有可能形成产业化的组织工程化软骨产品。

本发明为应用hBMSCs构建软骨提供了一个确实可行的技术体系，使用这种技术提供的简便方法，可以有效地体外诱导hBMSCs形成软骨组织并能够在体内进一步成熟。本发明人认为TGF-β₁、IGF-I和地塞米松等诱导因子均可能在不同程度上启动和维持了hBMSCs向软骨细胞分化的过程，而IGF-I更可能体现在对软骨样细胞功能表达的促进作用上，本发明确定的生长因子应用剂量和方法恰恰能够充分发挥各诱导剂对hBMSCs的促分化作用。而今后在本研究的基础上，应用转染TGF-β₁和/或IGF-I基因的hBMSCs作为种子细胞，不但克服了外源性细胞因子分布不均的缺点，而且节约成本，更加具有实际的应用意义。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。